实验1大肠杆菌的培养与分离

实验1大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌介绍.(看教材:P19)一、实验目的二、细菌的培养和分离2．细菌培养基种类3．接种工具和接种方法：1．细菌的营养物质：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子。LB固体培养基：用于细菌的分离4．细菌分离方法：（1）划线分离法（2）涂布分离法LB液体培养基：用于细菌扩大培养(看教材P19)三、灭菌操作（1）实验用具灭菌：（2）培养基灭菌：高压蒸汽灭菌（121℃、15min）A．能加热的培养基灭菌（1kg/cm2压力、15min）例外：有葡萄糖的培养基（500g/cm2压力、30min）B．不能加热的培养基：G6玻璃砂漏斗过滤（细胞不能通过)四、设备及用品(看教材P21)五、材料(看教材P21)(看教材P20)六、步骤③①②④（1）器具及培养基灭菌（2）自三角瓶向培养皿中转移固体培养基(倒平板）（3）将菌体放入液体培养基中培养(37℃摇床振荡培养12h)（4）菌液划线分离(37℃恒温培养12～24h),

出现不连续的单个菌落)（5）保存单菌落——划线法接种于斜面(4℃冰箱保存)。(看教材P22～23)问题讨论可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。1．培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？3．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。5．为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？6．在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。7．在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。教材思考与练习1．如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?2．在培养后如何判断是否有杂菌污染？3．进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置？4．实验完成后，接触过的器皿应如何处理？5．如果分离的是转基因的大肠杆菌、如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？大肠杆菌1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌2．大肠杆菌属肠道内共生菌；益处：①合成VB和VK；②产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。

③产生放疗和化疗的必用辅助药：rhGM-CSF

害处：①有些菌株对人体有害，可侵袭肠粘膜并产生毒素②引起肠外感染，如肾炎、膀胱炎等。革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家ChristainGram创立。细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。有芽胞的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；革兰氏阳性菌对青霉素敏感，大多数致病性的无芽胞杆菌、弧菌、螺旋体都呈现负反应。革兰氏阴性菌对链霉素敏感。

微生物的营养为微生物提供除C、N以外的各种元素K2PO4、MgSO4无机盐酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等，酵母膏、蛋白胨、组织提取液生长因子合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物。常用：铵盐、硝酸盐，其他：氮气、氨、尿素、牛肉膏、蛋白胨。氮源构成细胞物质、合成代谢产物，能源物质。主要是葡萄糖，其次有CO2、NaHCO3、脂肪酸、花生饼、石油。碳源功能来源营养物质LB液体培养基：蛋白胨0.5g

酵母提取液0.25g

氯化钠0.5g（维持一定渗透压）水50mLLB固体培养基：蛋白胨0.5g

酵母提取液0.25g

氯化钠0.5g（维持一定渗透压）

琼脂1g

水50mL接种工具接种方法平板划线操作用涂布分离法分离细菌步骤：a、加水b、装锅c、加热排气d、加热e、保温保压f、出锅适量，过少？过多？不要装的过满按对称方式旋紧四周固定螺栓100KPa，121℃，15min压力表降至0、温度降至100℃以下，打开排气阀，旋开螺旋。打开排气阀排气手提式灭菌锅的使用滤器编号

滤片平均滤孔

一般用途180~120

滤除粗颗粒沉淀，收集或分布粗分子气体240~80滤除较粗颗粒沉淀,收集或分布较粗分子气体315~40