生物化学 第四章 核酸

第四章核酸化学

主要内容：介绍核酸的分类和化学组成，重点讨论DNA和RNA的结构特征，初步认识核酸的结构特征与其功能的相关性；介绍核酸的主要理化性质和核酸研究的一般方法。核酸(nucleicacid)以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA（Deoxyribonucleicacid)脱氧核糖核酸RNA（Ribonucleicacid)核糖核酸第一节核酸通论一、核酸的研究历史和重要性二、核酸的种类和分布三、核酸的生物功能一.核酸的研究历史和重要性

1869

Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleicacid）；此后几十年内，弄清了核酸的组成及在细胞中的分布。1944Avery等成功进行肺炎球菌转化试验；1952年Hershey等的实验表明32P-DNA可进入噬菌体内，证明DNA是遗传物质。1953Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型，说明了基因的结构、信息和功能三者间的关系，推动了分子生物学的迅猛发展。1958Crick提出遗传信息传递的中心法则，60年代RNA研究取得大发展（操纵子学说，遗传密码，逆转录酶）。70年代建立DNA重组技术，改变了分子生物学的面貌，并导致生物技术的兴起。80年代RNA研究出现第二次高潮：ribozyme、反义RNA、“RNA世界”假说等等。90年代以后实施人类基因组计划（HGP）,开辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因时代：功能基因组学（functionalgenomics）蛋白质组学（proteomics）结构基因组学（structuralgenomics）RNA组学（Rnomics）或核糖核酸组学（ribonomics二、核酸的分类及分布、功能(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸

核糖核酸

90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。三、核酸的生物功能

(一)DNA是主要的遗传物质

1928年Griffith的细菌转化实验

1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。但人们对此持怀疑态度，理由是：（1）因认为蛋白相对分子质量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA相对分子质量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。1952年HersheyandChase的实验进一步证明DNA是遗传物质(二)RNA功能的多样性1.某些病毒的遗传物质;2.控制蛋白质的合成(最主要的功能）;3.遗传信息的加工;4.基因表达和细胞功能的调控;5.催化功能;6.在细胞分化和个体发育中发挥重要作用;7.在生命起源中可能有重要作用。第二节核酸的分子组成一、元素组成二、构件单位：核苷酸三、核苷酸的生物学功能一、元素组成主要元素组成：C、H、O、N、P(9~11%)与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9.5%。核酸含量＝磷含量Ｘ10.5

二、核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O三、嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式

四、核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）五、核苷酸

5´-NMP5´-NDP5´-NTPN=A、G、C、U

5´-dNMP5´-dNDP5´-dNTPN=A、G、C、T腺苷酸及其多磷酸化合物AMPAdenosinemonophosphateADPAdenosinediphosphateATPAdenosinetriphosphate

各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。在体内能量代谢中的作用：ATP——能量“货币”UTP——参加糖的互相转化与合成CTP——参加磷脂的合成GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成第二信使——cAMP六、核苷酸的生物学功能作为核酸的单体细胞中的携能物质（如ATP、GTP、CTP、GTP）酶的辅助因子的结构成分（如NAD）细胞通讯的媒介（如cAMP、cGMP）第三节RNA的结构一、

RNA的结构RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通过3’，5’磷酸二酯键形成的线形多聚体。（1）

组成RNA的戊糖是核糖（2）碱基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中还有一些稀有碱基。（3）天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是双螺旋结构。

双螺旋区一般占RNA分子的50%左右。二、

RNA的类型细胞中的RNA，按其在蛋白质合成中所起的作用，主要可分为三种类型。核糖体RNArRNA

转运RNAtRNA信使RNAmRNA

此外，真核生物细胞中有少量核内小RNA（smallnuclearRNAsnRNA）

OHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-OO—CH2GO=P—O-3′5′OHOO—CH2OHOHAO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA（一）、

tRNAtRNA约占全部RNA的15%主要功能：在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸。已知一级结构的tRNA有多种，每种tRNA可运载一种特定的aa，一种aa可由一种或多种tRNA运载。结构特点：①分子量在25kd左右，70-90b，沉降系数4S左右。②碱基组成中有较多稀有碱基。③3’末端为…CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。④5’末端大多为pG…或pC…⑤二级结构是三叶草形a.配对碱基形成局部双螺旋而构成臂，不配对的单链部分则形成环。三叶草型结构由4臂4环组成。b.氨基酸臂由7对碱基组成，双螺旋区的3’末端为一个4个碱基的单链区-NCCA-OH3’，腺苷酸残基的羟基可与氨基酸α羧基结合而携带氨基酸。c.二氢尿嘧啶环以含有2个稀有碱基二氢尿嘧啶而得名，不同tRNA其大小并不恒定，在8-12个核苷酸之间变动，二氢尿嘧啶臂一般由3~4对碱基组成。d.反密码环由7个核苷酸组成，大小相对恒定，其中3个核苷酸组成反密码子，在蛋白质生物合成时，可与mRNA上相应的密码子配对。

次黄嘌呤核苷酸（也称肌苷酸，缩写为I）常出现于反密码子中。反密码臂由5对碱基组成。1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象，提出碱基配对的“摆动学说”：认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。e.额外环在不同tRNA分子中变化较大可在3~18个核苷酸之间变动，又称为可变环。其大小往往是tRNA分类的重要指标。f.TψC环（假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷环）含有7个核苷酸，大小相对恒定。几乎所有的tRNA在此环中都含TψC序列。

TψC臂由5对碱基组成。

⑥tRNA的三级结构：二十世纪七十年代初科学家用X线射衍技术分析发现tRNA的三级结构为倒L形。

tRNA三级结构的特点是氨基酸臂与TψC臂构成L的一横，-CCAOH3’末端就在这一横的端点上，是结合氨基酸的部位。而二氢尿嘧啶臂与反密码臂及反密码环共同构成L的一竖，反密码环在一竖的端点上，能与mRNA上对应的密码子识别，二氢尿嘧啶环与TψC环在L的拐角上。在tRNA中碱基堆积力是稳定tRNA构型的主要因素。

（二）、mRNAmRNA是从DNA上转录而来的，其功能是依据DNA的遗传信息，指导各种蛋白质的生物合成，每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码。细胞内

mRNA种类很多，大小不一，但每种含量极低。从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。顺反子：是由顺反试验所规定的遗传单位，相当于一种蛋白质的基因。

1、真核mRNA（1）、3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA

PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶对mRNA专一，不作用于rRNA和tRNA。原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。polyA功能：a.PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。b.PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。（2）、5’-帽子5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5’-5’-磷酸二酯键。帽子结构有三种类型：O型（m7G5’ppp5’Np）I型（m7G5’ppp5’Nmp-Np）II型（m7G5’ppp5’NmpNmpNp）帽子的功能：a.可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。b.可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。

hnRNA内含子(intron)mRNA

外显子(exon)*真核生物mRNA成熟过程2、原核mRNA（多顺反子）原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5’帽子和3’polyA。举列：MS2病毒mRNA，3569b，有三个顺反子，分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补，这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。原核mRNA代谢很快，半寿期几秒至十几分钟。

（三）、rRNArRNA占总RNA的80%左右。功能：rRNA是构成核糖体的骨架，与核糖体结合蛋白一起构成核糖体，为蛋白质的合成提供场所。大肠杆菌中有三类rRNA（原核）5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA真核细胞有四类rRNA5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA原核生物

真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA70S（30S、50S）16S、5S、23S80S（40S、60S）18S、5S、5.8S、28S

三、RNA组

人们逐渐认识到DNA是携带遗传信息分子，蛋白质是执行生物学功能分子，而RNA即是信息分子，又是功能分子。为此20世纪末科学家在提出蛋白质组学后，又提出RNA组学。

目前RNA组的研究尚处在初级阶段，RNA组的研究将在探索生命奥秘中做出巨大贡献。

第二节脱氧核糖核酸（DNA）一、DNA的碱基组成组成DNA的四种碱基：A、G、C、T50年代，Chargaff，Markham等应用纸层析及分光光度计大量测定了各种生物的DNA碱基组成后，发现如下规律：1、A=T，G=C。即A+G=C+T。嘌呤与嘧啶的总含量相等。2、DNA碱基组成有严格的种的特异性，即不同的生物具有自己独特的碱基组成。3、碱基组成没有组织和器官的特异性。4、生长发育阶段、营养状态和环境的改变都不影响DNA的碱基组成。二、DNA的一级结构DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过3’，5’磷酸二酯键连接起来的线形或环状多聚体。核酸中的核苷酸以3’，5’磷酸二酯键构成无分支结构的线性分子。

书写方法：5’→3’5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’（在DNA中，3/-OH一般是游离的）在DNA分子中，不变的骨架成分磷酸二酯键被逐渐省略，真正代表DNA生物学意义的是碱基的排列顺序。遗传信息贮存在DNA的碱基排列顺序中，生物界生物的多样性即寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的精确的排列顺序中。三、DNA的空间结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNANa盐纤维的X光衍射数据提出了DNA的双螺旋结构模型。DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。相对湿度92%，DNA钠盐结晶，B—DNA。相对湿度75%，DNA钠盐结晶，A—DNA。Z—DNA。生物体内DNA绝大部分为B—DNA。（一）、B—DNA的结构1、两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’2、嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过3’,5’-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。

宽1.2nm宽0.6nm大沟小沟深0.85nm深0.75nm

3、螺旋平均直径2nm，每圈螺旋含10个核苷酸碱基堆积距离：0.34nm螺距：3.4nm4、两条核苷酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。碱基平面垂直于螺旋轴。A=T（两个氢键）、G=C（三个氢键）。碱基互补原则具有极重要的生物学意义，DNA的复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基互补。重要特性：1、DNA分子的长度往往很长，如：E.coli的DNA分子量为2.6x109或由4x106碱基组成，长度为1.4x106nm。长度和直径不对称，如此细长的分子对任何机械力作用都十分敏感。往往制备的DNA样品是降解了片段。2、DNA分子结构中的碱基互变异构体：A和C上氮原子常处于氨基的状态，G和T氧原子常为酮式。很少有亚胺和烯醇式。否则碱基互补配对就不复存在。A就很易和C配对，G就很易和T配对。另一方面，偶而也可形成亚胺和烯醇式，可能这就是DNA复制引起突变的原因之一，这种突变是生物进化的动力。3、DNA分子的稳定性：①碱基堆积力（主要因素）形成疏水环境。②碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。④碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。4、DNA分子的可塑性：在溶液中DNA分子具有较大的可塑性。由于分子上局部区域受热力学的作用，往往使DNA分子发生弯曲，缠绕或伸展。这种分子变形并不是由于互补碱基对之间的氢键瞬间断裂的结果，而是由于DNA分子多核苷酸链的骨架上的共价键的转角改变所引起的。

（二）、A-DNA的结构在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。A-DNA也是右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。（三）、Z-DNA的结构左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。说明B-DNA与Z-DNA之间是可以互相转变的。Z-DNA只有一条小沟。

四、环形DNA生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：某些病毒DNA、某些噬菌体DNA、某些细菌染色体DNA、细菌质粒DNA、真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA1、环形DNA的不同构象松驰环、解链环、负超螺旋（1）、松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、正超螺旋与负超螺旋DNA线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。对于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初级螺旋的碱基对数小于10.4，则其二级结构处于紧缠状态，是正超螺旋。如果每圈初级螺旋的碱基对数大于10.4，则其二级结构处于松缠状态，是负超螺旋。

2、拓扑异构酶此酶能改变DNA拓扑异构体的L值。①拓扑异构酶酶I（拧紧）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。②拓扑异构酶酶II（拧松）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。

五、

DNA的生物学功能直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。间接的证据：1、DNA分布在染色体内，是染色体的主要成分，而染色体是直接与遗传有关的。2、细胞核内DNA含量十分稳定，而且与染色体数目的多少有平行关系，体细胞（双倍体）DNA含量为生殖细胞（单倍体）DNA含量的两倍。3、DNA在代谢上较稳定，不受营养条件，年龄等因素影响。4、可作用于DNA的一些物理和化学因素，如：紫外线、X－射线、氮芥等都可以引起遗传特性的改变。第四节核酸的某些理化性质与常用的研究方法一、酸性化合物

两性解离，但酸性强电泳行为——泳向正极（pH7-8）等电点：RNApH2.0—2.5DNApH4.0—4.5二、核酸的水解DNA和RNA中的糖苷键与磷酸酯键都能用化学法和酶法水解。1、

酸水解：在酸性条件下DNA和RNA都会发生磷酸二酯键水解。并且碱基和核糖之间的糖苷键更易被水解，其中嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。2碱水解：RNA的磷酸酯键易被水解，而DNA的磷酸酯键不易被水解。室温，0.3--1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。DNA稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后降解。3、酶水解：水解核酸的酶有很多种，若按底物专一性分类：作用于RNA的称为核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）作用于DNA的则称为脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）。按对底物作用方式分类：核酸内切酶（endonuclease）、核酸外切酶（exonuclease）核酸内切酶是非常重要的工具酶，在基因工程中有广泛用途。而核酸外切酶只对核酸末端的3’，5’磷酸二酯键有作用，将核苷酸一个一个切下，可分为5’→3’外切酶，与3’→5’外切酶。

三、核酸的紫外吸收碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8，若大于1.8，表示污染了RNA。纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。

2、含量计算1个吸光度值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，吸光系数增大。减色效应：在DNA的复性过程中，吸光系数减小。

四、核酸的分离纯化要求：尽可能保持其天然状态。条件温和，防止过酸、过碱。避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。1、DNA分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/LNacl中，利用此性质，提取出DNP。DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。2、RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。去蛋白：盐酸胍、苯酚等必须防止RNA酶对RNA的破坏。五、核酸的沉降特性不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心就可以将它们区分开来。应用溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心，很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开，这一方法常用于质粒DNA的纯化。六、凝胶电泳1、琼脂糖电泳①

核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②

凝胶浓度③

DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。④

电流，不大于5V/cm电泳完以后，用荧光染料溴化乙锭染色。经紫外光照射，可发出红-橙色可见荧光。此方法十分灵敏，0.1ugDNA即可用此法检出。凝胶上的样品还可回收，供进一步研究之用。

2、

PAGE电泳聚丙烯酰胺凝胶孔径比琼脂糖凝胶要小，所以可用分析小于1000bp的DNA和RNA片段。也用溴化乙锭染色，但发出荧光很弱，浓度很低的样品不能用此法检测出来，需要用亚甲蓝或银染来显示。七、核酸的变性、复性和杂交变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。（一）、变性在一定理化因素作用下，核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链的现象称为变性。不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。热变性因素酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）

260nm吸收值升高。变性后粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。熔解温度（Tm）或称熔点：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在85—95℃之间。（浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37.当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。）8090100100%50%OD260