干细胞培养与鉴定

产品经理：施真解析：干细胞的培养与鉴定

主要内容1.干细胞原代提取及鉴定2.干细胞培养体系与操作细节的重要性3.OricellTM系列干细胞产品及售后服务2原代培养过程3原代取材组织来源（个体年龄、健康状况）

BMSC、ADSC：成人（18-45周岁）、大鼠和小鼠（4周龄）、兔和狗（1-3周龄）

NSC：大鼠（孕龄14.5天的胚胎）；小鼠（孕龄12.5天的胚胎）

ESC：小鼠（见栓后3.5天的孕鼠）取材部位

BMSC：髂骨或胸骨、后肢股骨和胫骨

ADSC：抽脂手术的脂肪组织或腹股沟

NSC：胚胎大脑GE区

ESC：囊胚内细胞团45间质干细胞（MSC）定义：来源于中胚层的早期细胞，能够分化为多种中胚层和神经外胚层来源的细胞。来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血等。来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、猪等。6广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。神经干细胞（NSC）7胚胎干细胞(embryonicstemcellES,细胞)是指胚泡期的内细胞团中分离出的尚未分化的、能在体外培养、具有发育全能性的早期胚胎细胞无限增殖、自我更新可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型胚胎干细胞（ESC）分离细胞分离方法的选择BMSC：密度梯度离心法（人、猴、狗）

贴壁筛选法（大鼠、小鼠、兔）ADSC：胶原酶消化法NSC：无血清培养基自然筛选法ESC：囊胚内细胞团迁移法8密度梯度离心法密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。试剂：

Ficoll淋巴细胞分离液，分离出密度在1.077±0.001g/L之间的淋巴细胞9用1xPBS按照

1：1的比例稀释骨髓；稀释后的骨髓沿离心管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上；离心；离心完毕，小心吸取中间云雾状单个核细胞层；离心，加入培养基重悬接种；3天之后首次换液；其后，每隔2-3天换液；待细胞到80%融合的时候进行传代。10密度梯度离心法11取大鼠/小鼠的后肢股骨和胫骨；用1mL注射器吸入培养基后冲洗骨髓腔，将骨髓全部冲洗出来；骨髓悬液进行离心；弃上清，用培养基重悬细胞，接种到1个T25或者T75培养瓶中；3天后换液，以后每隔2-3天换液，待细胞80-90％融合时传代。贴壁筛选法扩增传代传代时机的控制（MSC为例）细胞汇合度的判断传代消化时间的控制接种密度的控制培养体系的选择12扩增传代-细胞汇合度的判断(MSC)

13扩增传代-消化时间的控制(MSC)14细胞消化15s细胞消化35s细胞消化55s不同物种、细胞类型之间接种密度有差异MSC、ADSC：2×104/cm2~4×104/cm2NSC：1.0-2.0×105cells/mLESC：1×104/cm2~2×104/cm215扩增传代-接种密度的控制纯化鉴定16纯化方法：多次传代进行纯化常规检测：细菌、真菌检测；支原体检测；内毒素检测；鉴定检测：增殖能力、生长形态、特异性抗原表达、核型分析、诱导分化能力等常规检测17鉴定检测共通项目复苏存活率

台盼蓝拒染法--如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。18鉴定检测共通项目19细胞倍增时间：生长曲线测定（计数法或者CCK8法)细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此区间进行。可在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。形态学表面抗原标记多向分化能力20MSC（间质干细胞）鉴定检测MSC（间质干细胞）鉴定检测形态学:梭形、成纤维样细胞原代：克隆样生长传代后：均质、旋涡状排列21HumanDogMonkeyMouseRatRabbitMSC（间质干细胞）鉴定检测表面抗原标记（流式鉴定）：

MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性,它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。22MSC（间质干细胞）鉴定检测23MSC（间质干细胞）鉴定检测诱导分化能力鉴定：成骨诱导（茜素红染色）24诱导前（汇合度65%-70%）染色前成骨诱导25MSC（间质干细胞）鉴定检测诱导分化能力鉴定：成脂诱导（油红O染色）26诱导前（融合度90-95%）成脂染色前诱导分化能力鉴定：成软骨诱导（阿利新蓝染色、三维培养法）27MSC（间质干细胞）鉴定检测染色前石蜡切片后染色图片形态学特征：可做悬浮培养或贴壁培养特异性抗原表达：Nestin分化能力：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞28NSC（神经干细胞）鉴定检测29大鼠神经干细胞-悬浮培养大鼠神经干细胞-贴壁培养小鼠神经干细胞-贴壁培养小鼠神经干细胞-悬浮培养NSC（神经干细胞）鉴定检测-形态学30NSC（神经干细胞）鉴定检测特异性抗原表达Nestin(神经干细胞标志物)阳性表达率≥75%

β3-tubulin（神经元标志物）阳性表达率

≤10%GFAP(星形胶质细胞标志物)阳性表达率≤10%GalC或OSP（少突胶质细胞标志物）阳性表达率≤10%31NSC（神经干细胞）鉴定检测RatNSCnestinstainingMouseNSCnestinstaining分化能力自然分化

加入含血清培养液，继续培养约7天，可分化为神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。三者的分化比例约为(16±7)%，(75±7)%和(5±3)%。定向分化

1.神经元方向分化：用无血清无生长因子诱导液诱导，可使分化比例升至60%以上。2.少突胶质细胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。32NSC（神经干细胞）鉴定检测33神经元方向分化（TubulinStaining)星型胶质细胞方向分化（GFAPStaining)RatNSCNSC（神经干细胞）鉴定检测34少突胶质细胞方向分化（OSPStaining）NSC（神经干细胞）鉴定检测形态学：集落样或克隆样生长特异性转录因子/抗原表达：表达OCT-4，Nanog；SSEA种属间表达有差异染色体结构：传代过程中保持正常稳定的核型全能性：具有向胚胎的三个胚层来源的所有细胞分化的能力35ESC（胚胎干细胞）鉴定检测36小鼠ES：紧密牢固结合、多层密集立体生长，呈堆积状，边缘清楚，细胞核大、核仁明显、核浆比高。

人ES：相对松散、扁平状集落,集落内细胞界限隐约可见ESC（胚胎干细胞）鉴定检测-形态学有MEF

无MEF，无血清培养体系

特异性表达37抗原Oct-4NanogSSEA-1SSEA-3SSEA-4人ES++—++小鼠ES+++——ESC（胚胎干细胞）鉴定检测染色体结构核型分析：正常稳定的二倍体核型，小鼠（40，XX/XY)。不随传代次数而改变。38ESC（胚胎干细胞）鉴定检测39小鼠ES核型分析：40，XYESC（胚胎干细胞）鉴定检测核型分析：显色技术全能性体内分化：畸胎瘤实验体外分化：EB（拟胚体）形成实验40ESC（胚胎干细胞）鉴定检测体内分化41将细胞注射入（约106个）SCID（重症联合免疫缺陷）或裸鼠体内，约4周后（人ES可能需要8~10周），可见细胞注射处有肿块生成，处死小鼠，肿瘤固定后做石蜡包埋，切片，普通HE染色后观察。ES可在小鼠体内生长、分化、形成含有三个胚层来源的良性畸胎瘤。ESC（胚胎干细胞）鉴定检测体外分化42ESEB贴壁诱导约5~7天后出现自主性搏动ESC（胚胎干细胞）鉴定检测43刚接触干细胞，不知道该用什么培养基？费尽心血提取的干细胞养了几代就老化了？原代取材杂细胞太多？细胞生长不均匀，有的地方密有的地方稀？操作其他细胞都没问题，养干细胞就出现了污染？

………….干细胞培养体系与操作细节的重要性44

干细胞的研究和利用过程中，最主要的提供最适生长环境，保持培养开始时细胞群体的状态，这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规。

培养体系的选择干细胞饲养员必备素质-细节决定成败无菌意识，重中之重规范化的无菌操作超净台取用物品摆放、操作时细节问题环境的控制

培养箱的定期消毒、水浴锅定期换水、大环境的控制等生物试剂使用前仔细阅读产品说明书操作干细胞时动作轻柔复苏、传代、冻存等步骤重悬细胞的过程培养基使用前复温、细胞接种之后摇匀、各种干细胞接种密度的控制、试剂保存时避免反复冻融等4546

干细胞细胞培养耗材、分子耗材培养基细胞因子

冻存液OricellTM系列干细胞产品及售后服务干细胞相关试剂及耗材47OricellTM系列无蛋白非程序冻存液4849细胞培养耗材的选择干细胞培养板、培养瓶

（特殊TC处理表面，更适用于干细胞的贴壁培养）神经元/神经干细胞培养板

（多肽包被，无需PLL/Laminin预处理，保存时间长）15ml、50ml离心管（透明度更高、耐更高转速）分子生物学耗材（

Labcon系列）全美进口●55周年历史●FDA/USP认证吸头微量离心管PCR产品系列储样管、储样架等OricellTM系列耗材Cyagen团队特别针对免疫