无病毒苗木培育

第十章无病毒苗木培育

目的与要求

了解脱毒意义，学习植物茎尖脱毒原理及其操作程序，了解其他组织脱毒方法及应用，掌握植物理化脱毒方法。学习植物脱毒苗的鉴定方法，掌握各方法的鉴定原理，了解植物脱毒苗的保存和繁殖方法。具备植物茎尖脱毒技术基础，具有指示植物鉴定脱毒苗的基本能力，有脱毒苗保存的认知。

1952年Morel等培养大丽花茎尖获得第一株植物脱毒苗，1955年又获得了马铃薯脱毒苗。20世纪70年代，几乎所有生产马铃薯的国家都在生产中使用这一技术，到1975年，用该技术生产脱毒种薯的马铃薯品种已达150个左右。

1974年中国科学院植物研究所等开展马铃薯茎尖培养脱毒技术的研究及应用推广工作，80年代中期脱毒马铃薯进入生产阶段，90年代中期脱毒马铃薯已经覆盖了我国的大部分马铃薯产区，创造了可观的经济效益。

1971年日本人Mori获得了首例大蒜茎尖培养脱毒苗。法国率先将脱毒蒜种应用与生产，并出口到澳大利亚等国。我国于80年代初获得脱毒苗。1988年以来，山东省农业科学院蔬菜研究所探明了侵染我国大蒜的主要病毒种类，提出了一套脱毒蒜快繁技术，提高繁殖系数7-10倍，提出了良繁体系，缩短了繁种周期，降低了生产成本，现在脱毒蒜种已在我国大面积应用于生产。

1988年，山东省农业科学院植物研究所进行甘薯病毒病调查毒源鉴定工作，明确了侵染甘薯的病毒种类，传毒介体的传播途径，形成了茎尖培养、病毒检测、脱毒种薯的快繁和推广应用的配套技术。此外，芋头、大姜脱毒种在我国、日本、泰国等地已投放市场。多种蔬菜、果树、林木、药用植物的脱毒快繁技术研究和应用也发展迅猛，有些已形成具一定规模的工厂化产业

全世界已发现植物病毒有近788种。

病毒的危害：组织和细胞病变新陈代谢等生理机能受到干扰外观表现不正常状态由于危害可通过营养体传给后代，病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。世界作物生产中，病毒危害程度仅次于真菌。

危害一些植物的病毒数目植物种类感染病毒种类植物种类感染病毒种类植物种类感染病毒种类菊花19矮牵牛5苹果36康乃馨11百合6柑橘23水仙4马铃薯17葡萄26唐菖蒲5大蒜24草莓24风信子3豌豆15桃23月季10樱桃44梨11所谓脱毒就是采用一定的方法除去植物体内病毒的技术。

无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。应用植物脱毒技术意义植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特性，生长势增强，明显提高产量、改善品质，产量的提高幅度最高可达300%。植物脱毒技术不仅脱除了病毒，还可以去除多种真菌、细菌及线虫病害，使种性得以恢复，植株生长健壮，减少肥料和农药施用量，降低生产成本，保护了环境一、植物脱病毒的机理病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分布。在受侵染的植株中，顶端分生组织无毒和含毒量极低。较老组织的含毒量随着与茎尖距离的加大而增加。

分生组织含毒量低的原因可能是：1）植物病毒自身不具有主动转移的能力，无论在病田植株间还是在病组织内，病毒的移动都是被动的。在植物体内，病毒可通过维管束组织系统长距离转移，转移速度较快，而分生组织中不存在维管束。病毒也可通过胞间连丝在细胞间移动，但速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖。2）在旺盛分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制。3）在植物体内可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。4）在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒的增殖。第一节植物脱毒方法一、茎尖培养脱毒

（一）通过茎尖培养脱毒的原理

1、病毒在植物体内的分布

病毒浓度不同，离尖端越远病毒浓度越高。茎尖或根尖，离体培养便可获得无病毒再生植株。

2、茎尖大小与脱毒

茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。茎尖分生组织不能合成自身需要的生长素，但下部叶原基能提供，因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。但茎尖越大，脱毒效果差。（二）茎尖脱毒方法

1、取样与消毒

可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种。

消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。

酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿2、茎尖剥离和接种

将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上—器械固定—解剖镜下剥去幼叶—切下带1-2个叶原基的生长点（0.3-0.5mm）—切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。酒精擦拭旋转灼烧显微镜下获取茎尖接种盖好瓶塞脱毒马铃薯试管苗3．培养

25+2℃

，1500-5000LX，10-16h

一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从生芽。

4．生根诱导

诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2个月可生根。（三）培养基与培养方式

1、培养基：MS，White,Morel等

2、培养方式：一般采用半固体培养基。

（四）影响茎尖脱毒效果的因素（茎尖脱毒技术的关键）

植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小（0.3-0.5mm带1-3个叶原基）、培养基营养

用于脱毒的适宜茎尖大小植物病毒名称剥离茎尖大小（mm）植物病毒名称剥离茎尖大小（mm）马铃薯马铃薯卷叶病毒马1.0～3.0百合花叶病0.2～1.0铃薯Y病毒1.0～3.0鸢尾花叶病0.2～0.5马铃薯X病毒0.2～0.5菊花各种病毒0.2～1.0马铃薯G病毒0.2～0.3康乃馨各种病毒0.2～0.8马铃薯S病毒0.2以下大丽花花叶病0.6甘薯斑纹花叶病毒1.0～2.0大蒜花叶病毒0.3～1.0缩叶花叶病毒1.0～2.0甘蔗花叶病0.7～3.0羽毛状花叶病毒0.3～1.0草莓各种病毒0.2～1.0二、热处理脱毒

脱毒原理

即热处理脱毒，一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40度）即钝化失活。

1、温汤浸渍处理脱毒法材料置于50℃左右热水中浸渍几十分钟到数小时。

特点：简单易行，成本低，但易使材料受伤。适用：甘蔗、木本植物和休眠器官的处理。

2、热空气处理脱毒法将植物用35～40℃的热空气处理2～4周或更长时间。

特点：损伤较小，操作简便，须严格控制温度时间

适用：多数植物

3、热处理结合茎尖培养脱毒目前常采用将热处理和茎尖分生组织培养结合起来的方法脱毒。特点：既可缩短热处理时间，提高植株成活率，又可剥离较大的茎尖，提高茎尖培养的成活率和脱毒率。适用：大多数植物，并可除去一般培养难以去除的纺锤块茎类病毒三、其他组织培养脱毒方法

（一）愈伤组织培养脱毒

将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病害毒植株的方法，即愈伤组织培养脱毒法。

部分愈伤组织细胞不带病毒可能有以下两方面的原因：

一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快，而病毒复制速度较慢，赶不上细胞的繁殖；

二是愈伤组织发生了抗病毒突变。（二）珠心胚培养脱毒

柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外还有珠心胚，种子一般不带病毒，因此珠心胚植株不易带病毒。

（三）微尖嫁接脱毒

指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖（0.14-1.0mm,带3-4个叶原基），以培养脱毒苗的技术。

脱毒程序：无菌砧木培养——茎尖准备——嫁接——嫁接苗培养——移植。第二节脱毒苗鉴定

一、直接检查法

直接观察待侧植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否存在。

二、指示植物法

将一些对病毒反映敏感，症状特征显著的植物作为指示植物，用以检验待测植物体内特定病毒的存在。即指示植物法。

特点：条件简单，操作方便，经济而有效，只能测出病毒的相对感染力。一些常见病毒病引起的可见病症症状病毒病名称症状病毒名称褪绿、黄化小麦黄矮病斑点十字花科黑斑病花叶、斑驳烟草花叶病、菜豆花叶病、黄瓜花叶病猝倒、立枯棉花立枯病、瓜苗猝倒病、水稻烂秧病溃疡杨树溃疡病、柑桔溃疡病，番茄溃疡病萎蔫棉花枯萎病、茄科植物青枯病枯死马铃薯晚疫病、水稻白叶枯病矮化玉米矮化病、泡桐丛枝病、小麦丛矮病穿孔桃细菌性穿孔病徒长水稻恶苗病疮痂柑桔疮痂病、梨黑星病、马铃薯疮痂病卷叶马铃薯卷叶病指示植物法几种马铃薯病毒的指示植物及表现症状病毒种类指示植物表现症状马铃薯X病毒（PVX）千红日、曼陀罗、辣椒、心叶烟脉间花叶马铃薯S病毒（PVS）苋色藜、千日红、曼陀罗、昆诺阿藜叶脉深陷，粗缩马铃薯Y病毒（PVY）野生马铃薯、洋酸菜、曼陀罗随品种而异，有些轻微花叶或粗缩，敏感品种反应为坏死马铃薯卷叶病毒（PLRV）洋酸菜叶尖呈浅黄色，有些品种呈紫色或红色（一）草本植物鉴定1、汁叶涂抹法被鉴定植物取1～3克幼叶—加10毫升水及少量磷酸缓冲液-研碎过滤-加金钢砂作麾擦剂-汁液在叶面上涂抹2～3次接种2、小叶嫁接法指示植物作砧木，被鉴定植物小叶作接穗，常用劈接法。（二）木本指示植物鉴定1、直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片2、双重芽嫁接3、双芽嫁接法部分病毒的木本指示植物及相应症状病毒种类木本指示植物表现症状苹果褪绿叶斑病毒苏俄苹果叶片出现褪绿斑点，叶小，植株矮化，长势弱苹果茎痘病毒司派227或光辉叶片反卷，植株矮化，皮层坏死苹果茎沟病毒弗吉尼亚小苹果植株矮小，接合部内有深褐色坏死环纹，木质部产生深褐色纵向条沟苹果花叶病毒兰蓬王、红玉和金冠叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑苹果锈果类病毒国光叶和茎干锈斑、坏死斑葡萄扇叶病毒葡萄茎痘病毒沙地葡萄圣乔治叶片出现褪绿斑点、线纹斑及环斑、局部坏死、畸形；叶脉间出现星状透明斑葡萄卷叶病毒欧亚种葡萄叶片下卷、叶脉间变红葡萄茎沟病毒Kober5BB仅在Kober5BB上会产生茎沟葡萄栓皮病毒LN33节间肿大，部分叶片背面出现栓皮葡萄金黄病毒Baco22A植株矮化，叶片下卷、黄化葡萄脉坏死病110R叶片背面沿叶脉出现坏死斑，卷须和嫩梢坏死葡萄脉斑驳病河岸葡萄褪绿斑，沿脉斑驳，叶片畸形柑橘碎叶病腊斯克枳橙、特洛亚枳橙、卡里佐枳橙和厚皮来檬新叶上出现叶片扭曲，叶缘残缺呈破碎状三、抗血清鉴定法

特异性高，测定速度快，几小时甚至几分钟就可以完成。植物病毒鉴定中最有用方法之一。

（一）原理

刺激抗体产生蛋白质抗原。抗原与抗体间能发生高度专一性的血清学反应（免疫反应）

三、抗血清鉴定法



（二）方法

1、叶绿体凝集法

2、块茎沉淀法

3、环形接口法

4、酶联免疫法：用梅标记抗原或抗体的微量测定法。现在灵敏度较高和常使用的方法。四、分子生物学鉴定

1、双链RNA法

通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。

2、互补DNA（cDNA）检测法

也叫DNA分子杂交法

五、电镜检测法

运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态等对病毒种类进行鉴定。是较为先进的方法，但需一定的设备和技术。

第三节无病毒苗的保存和繁殖通过不同脱毒方法所获得的脱毒植株，经鉴定确系无特定病毒者，既是无病毒原种。无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好保存，这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用5～10年。一、无病毒苗的保存（一）隔离保存通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目，即网眼为0.4～0.5mm大小的网纱，也可用盆栽钵。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。（二）长