细胞复苏与计数

细胞复苏从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37～40℃水浴中，快速摇晃直至完全融化（最好在1min内完成，融化时水不要浸过冻存管的盖子）将冻存管直接离心，1500rpm，5min；弃上清液，加入含10%血清的培养液1ml重悬细胞，将细胞悬液接种于新的培养瓶，加入3ml新鲜的培养液，置37℃培养箱培养。次日更换一次培养液，继续培养。注意事项将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；冻存和复苏最好用新配制的培养液。细胞计数细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞数目，以调整植入的细胞血细胞计数板是一块长方形的硬质厚玻璃板，板上有两个刻度平台，每个平台划分为9个大方格，每个大方格的面积为1平方毫米，加特制盖片（厚度0.7毫米）后的深度为0.1毫米。中心为一个大方格以双线等分为25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。中心大方格供红细胞计数和血小板计数用，四角的四个大方格供白细胞计数用。取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液(10ul)沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。将血球计数板置于显微镜的低倍镜下观察，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝四个大格子细胞数/4*104*稀释倍数说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3＝1*10-4

ml

25格*16格的血球计数板RBC计算公式RBC数/ml=80小格RBC数/80*400*104*稀释倍数细胞计数要点1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。

2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确。

4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

Zseries细胞计数仪：美国BECKMANCOULTER20ml缓冲液+200ul样品（101倍）操作步骤A549细胞一瓶，将培养液去掉，加入D-Hanks3ml使液体覆盖在细胞生长面，轻轻晃动培养瓶，去液体。加入消化液500ul，使消化液覆盖于细胞面上。(一般消化时间为1到5分钟，以镜下观察为准:细胞质回缩，胞体变圆可终止消化)加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。将细胞瓶中的细胞悬液移至15ml离心管中，用D-HANKS将液体总量加至5ml,混匀，吸取200ul细胞悬液置于1.5ml的EP管中用于计数。剩下的细胞悬液以1500rpm离心5min。去上清，根据计数的结果用新鲜培养液调整细胞悬液浓度为1*105细胞数/ml。接种孔板以1*103、2*103、4*103、8*103、1.6*104接种于96孔板中，每个浓度接种3个复孔，最后加3个空白对照孔（共18孔），然后每孔加入培养液200ul。将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及