研究生开题报告

学术论文开题报告

基质金属蛋白酶与癫痫发病的关系专业名称：神经病学研究方向：癫痫协作单位：青大医学院日期：2004年12月28日一、选题的目的和意义（主要说明：进行研究的必要性、预期达到的目的、实际应用价值和学术意义）本研究是为了明确基质金属蛋白酶及其组织相容性抑制因子（MMPs/TIMPs）是否参与了癫痫的发病，可能是以怎样的机制参与。通过该试验，应可证实：MMPs/TIMPs，主要是MMP-9/TIMP-1参与了癫痫的发病，可能是通过增加了血脑屏障的通透性，加强了脑内的免疫反应，损害了神经元与神经胶质细胞，影响突出重建，从而影响癫痫放电环路的形成。同时该试验可指导临床上选择特异性MMPs抑制因子，抑制该病理过程，从而缓解癫痫的发作。这将为癫痫的免疫学机制提供有意义的线索。二、国内外研究动态引文癫痫的发病机制非常复杂，目前关于癫痫的免疫学发病机制的研究，主要集中在脑组织抗原和抗脑抗体的寻找。星形胶质细胞相关抗原在发生免疫反应和损伤的脑屏障部位，与外周循环免疫系统发生接触，并且其相应特异性抗体以遵循同一途径进入脑组织内，造成该胶质细胞的免疫损伤，破坏了脑神经冲动传导的反馈抑制环路的平衡而导致兴奋性神经元过度放电和传播。当这种过度放电达到一定强度和范围时，即会发生痫性抽搐。MMPs/TIMPs是中枢神经系统与外周神经系统免疫反应发生联系的物质，它与癫痫的关系越来与引起人们的关注。MMPs是一组结构中含有Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶家族，是催化细胞外基质降解的主要酶类之一，几乎能降解细胞外基质的所有成分，如胶原蛋白、蛋白多糖、纤维结合蛋白等。在中枢神经系统中[1]主要来源于血管内皮细胞，浸润入脑的炎症细胞及中枢神经系统固有细胞如星形胶质细胞和小胶质细胞。MMPs共有二十多个成员，根据作用底物不同分为四类，即（1）胶原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)；（2）明胶酶(MMP-2、MMP-9)；（3）基质溶解酶(MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12)；（4）模型基质金属蛋白酶(MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17)。。MMPs的功能主要有二，一是几乎能降解除了糖以外的所有细胞外基质成分，其二是激活别的MMPs，形成瀑布效应。MMPs的自我平衡调节是通过其内源性抑制因子TIMPs完成的。TIMPs家族主要有四个成员（TIMP-1、－２、－３、－４）,他们与MMPs间的特异性抑制关系并不十分清楚.但TIMP-1和TIMP-2分别对MMP-9和MMP-2有较特异的抑制作用[2]。MMPs／TIMPs与血脑屏障（BBB）

BBB通透性增强，与血管性水肿及颅内高压相关。某些致病因素如感染、偏头痛、中风，外伤等，可通过使内皮细胞收缩[3]

或者释放蛋白酶和自由基[4]等机制激活MMPs而改变血脑屏障的通透性［2、4，5］。MMPs破坏内皮细胞紧密连接、周细胞（pericyte），星形胶质细胞足突和基膜。基膜内含有ECM如胶原蛋白Ⅳ，层粘连蛋白和纤维连接蛋白，大多数是MMPs的底物（特别是MMP-2和MMP-9）。这可能是BBB通透性增加的主要原因。脑内MMPs特别是MMP-9随着血脑屏障通透性增高而增高。MMPs具体通过何机制引起血脑屏障破坏，仍待进一步研究。血脑屏障破坏后，炎症细胞及其产生的致病因子进入脑组织，引起脑损伤。

MMPs／TIMPs与中枢神经系统免疫反应

MMPs与中枢神经系统感染及自身免疫性疾病（如多发性硬化）相关，参与了中枢神经系统的免疫反应。病毒［1，6］侵入机体，激活T淋巴细胞，浸润至中枢神经系统，通过分泌细胞因子刺激中枢神经系统固有细胞（主要是星形胶质细胞）表达MMPs，TIMPs（MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-12和TIMP-1、TIMP-2、TIMP－3）。激活的T淋巴细胞也可和星形胶质细胞相互作用，使后者表达MMP-3、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2。MMP-9的活性还与浸润到脑的中细粒细胞有关，在脑组织血管周隙的神经细胞中可有单核细胞浸润表达的MMP-9，这与淋巴细胞通过血脑屏障的能力有关[7]与此役以相同的是YushchenkoM等[29]发现，MMP-9的表达与各种神经系统疾病的脑脊液中细胞数升高有关。若脑脊液中细胞数正常，MMP-9的表达水平就没有改变。T淋巴细胞产生的细胞因子包括前炎症细胞因子（TNF-α，TNF-β，IL-1α）和抗炎症细胞因子（IL-4，IL-5）；前炎症细胞因子使MMP-3，MMP-9和TIMP-3表达上调[9]，而抗炎症细胞因子与TIMP-1的表达上调有关。前炎症细胞因子诱导MMPs过表达[8]，但对TIMPs的影响较小，引起MMPs/TIMPs表达的平衡失调。T淋巴细胞刺激星形胶质细胞产生TIMPs，是控制MMPs的上调的反应。但在该试验模型中TIMP-1和TIMP-3未抑制蛋白酶活性。这可能与MMP-3表达增多有关，MMP-3参与激活酶原形式的MMP-9，这就从另一方面加剧了MMPs/TIMPs表达比例的失调。所以说，MMPs/TIMPs平衡的改变与免疫介导的中枢神经系统疾病，包括T淋巴细胞激活，高度相关。淋巴细胞透过血脑屏障依赖于黏附分子的协调连接[11]，细胞因子及其受体相互作用，也需要MMPs和TIMPs的作用。可通过增加BBB的通透性，促进免疫分子透过血脑屏障［2，12］。T淋巴细胞不仅能产生MMPs，还能产生TIMP-1，其透过血脑屏障的能力较B淋巴细胞低。但MMPs在免疫细胞透过血脑屏障过程中的具体作用并不清楚。TNF-α和IFγ[13]诱导单核细胞和巨噬细胞缝隙连接的形成，细胞－细胞缝隙连接的形成，整合蛋白介导的细胞粘附[6]也参与了MMPs水平的改变。在多发性硬化中[14,15]，CD8＋细胞毒性T淋巴细胞表达MMPs，MMPs通过参与BBB的破坏，使中枢神经系统脱髓鞘和抗原决定簇扩散，而中枢神经系统髓鞘的持续降解可暴露额外的自身抗原，使自身免疫反应持续存在。ONO-4817（一种人工合成MMPs抑制因子）可以通过抑制MMPs，T淋巴细胞增殖和减少TNF-α生成，进而显著减轻BBB的破坏，又可抑制炎症细胞浸润和髓鞘破坏，从而有效延缓实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）[16]。也即，MMPs通过免疫机制参与了多发性硬化脱髓鞘的病理变化。在与人类免疫缺陷病毒－1相关的痴呆的研究过程中[17]，MMPs／TIMPs通过影响了单核巨噬细胞的迁移，参与其病理过程。病毒感染和／或免疫激活单核细胞转化而成的巨噬细胞及胎儿小胶质细胞，表达MMP-1、-2、-3、-9、TIMP-1，TIMP-2。MMPs的表达促进了单核巨噬细胞的分化，小胶质细胞表达的MMPs激活了CD40配体介导的细胞。MMPs引起BBB也参与了这一过程，淋巴细胞和单核细胞通过血脑屏障进入脑内发挥其病理作用。MMPs还可能通过直接的降解脑内ECM，参与了该病理过程。MMPs/TIMPs在癫痫脑中表达的研究在海人酸(KA)诱导的癫痫模型中，痫性发作后，可检测到MMP-9mRNA和MMP-9蛋白的表达上调，MMP-9活性增强[18]，TIMP-1mRNA和TIMP-1蛋白的表达上调，TIMP-1的活性也增强［19］。充分提示MMP-9/TIMP-1与痫性发作相关。同时报道还提示，以上改变呈时间依赖性和部位特异性MMPs的表达原位杂交和免疫组化分析［19］，正常情况下，MMP-9在神经元表达丰富，在胶质细胞中表达很低。亚细胞水平研究发现，MMP-9主要集中在核周区，也可在近树突区。而MMP-2的表达则不同，该实验中主要在星形胶质细胞中表达，而Vaillant等［20］发现MMP-2主要表达在小脑神经元和它们的树突，而不是胶质细胞中，Zuo等［21］在树突生长带测到MMP-2。这些差异可能与各实验中应用的抗体不同有关。但正常成年大鼠中枢神经系统中确实有MMPs的表达，而且表达水平和在细胞中的分布的差异可能受神经元发育和/或神经元功能状态调节。KA注射后，MMP-9mRNA、MMP-9蛋白和酶活性特异性的时空分布特点。在海马，KA理后2h，酶原形式的MMP-9的活性已增高，6h达高峰，24h时其活性开始降低，但仍高于对照组。24h之后，随着酶原形式MMP-9的降低，其活性形式逐渐增多。在早期，MMP-9的聚集是由突触活动增强引起的，是神经元活动依赖性的［22］。后期，是一些参与组织重塑的因子使MMP-9mRNA上调并转化为活性形式，这些因子包括神经营养因子，生长因子和粘附分子。MMP-9mRNA主要分布在海马CA1和CA3的颗粒细胞层和齿状回的颗粒细胞，MMP-2mRNA分布较均一，尤其在大脑灰质，但表达水平较MMP-9mRNA低。MMP-9主要分布在齿状回的颗粒细胞和部分胶质细胞，在CA1－3区和齿状回MMP-2的表达极低。KA注射后，MMP-9mRNA在齿状回颗粒细胞的树突区表达增多，活性增强，。说明MMP-9mRNA从胞体转移至树突区，该转移促进了树突合成突触蛋白［23］。该试验同时发现，易损区（CA1、边缘皮质，杏仁体区）未能测到MMP-9蛋白和及其mRNA，提示MMP-9不会引起细胞死亡。而重组MMP-9能选择性诱导培养基上锥体细胞的死亡，并能加剧KA诱导的神经元活动而引起的神经元死亡。也就是说，MMP-9与神经元死亡的关系并不明确。另有研究提示，KA注射后12h，颞叶MMP-9的表达，在成年大鼠较幼年鼠显著增多。以上资料表明，MMPs特别是MMP-9参与了兴奋毒性反应后神经元的损害，以及继发的神经炎症反应，可能通过影响突触的生理活性，参与了兴奋依赖性的树突结构重建。TIMPs的表达RiveraS[24]等用KA诱导大鼠兴奋毒性发作，观察其中枢神经系统中TIMP-1的表达。结果显示，TIMP-1在痫性发作后是作为一种早期反应基因，先在神经元中被诱导而表达上调。随后，在胶质细胞中的表达也增强。KA处理后，TIMP-1mRNA首先在海马区迅速增多；KA注射后8h，TIMP-1蛋白在围胞体区和树突-轴突的免疫反应增强；KA处理后3d，免疫反应在胶质细胞和抵抗性神经元如齿状回细胞的胞体及树突-轴突区增强。提示：TIMP-1在联系痫性发作引起的神经元和胶质细胞早期细胞反应事件和介于组织重组和/或神经保护长时间变化的调节过程中，可能有一定的作用。痫性发作改变了神经元内TIMP-1分布和表达水平。多数相关研究中，痫性发作后TIMP-1mRNA表达上调，随后通常有TIMP-1免疫反应的增强。事实上，KA注射后90分钟时，齿状回颗粒细胞TIMP-1mRNA的大量而快速表达。KA注射后8h时，TIMP-1免疫活性的增高。KA注射后72h，TIMP-1mRNA恢复到对照组水平时，颗粒细胞免疫反应升高。海马区在KA注射后8-16h，TIMP-1免疫反应主要在锥体细胞和颗粒细胞的围胞体区和树突区增强，说明TIMP-1蛋白通过分泌途径转移定位。KA注射后72h，TIMP-1的免疫反应不仅在海马的树突-轴突区显著增强，在颗粒细胞胞体也显著增强，提示随着时间的改变，TIMP-1的合成、贮存、运输和分泌的调节不同。这些神经元内TIMP-1的迟发性聚集，可能是由于在胶质细胞主要作用于胞外TIMP-1库时，其分泌减少。此时，CA1区变性，持续的TIMP-1mRNA表达与该亚区神经元内免疫反应增强无关。这表面上的矛盾可能由于TIMP-1转化能力改变，或者由于该蛋白的蛋白分解作用增强。此外，胶质细胞浸润到CA1神经元层可能对保持较高的TIMP-1mRNA水平有作用。结果提示：在易损CA1神经元内TIMP-1蛋白的缺乏和抵抗的颗粒细胞TIMP-1蛋白的表达之间存在有意义的联系。在脑的兴奋毒性发作中，局灶的MMPs/TIMPs比例改变，有病理学意义。TIMP-1先在神经元，之后在胶质细胞表达，说明TIMP-1的转导调节在痫性发作脑内可能有细胞和刺激依赖性。尽管神经元的高度兴奋性可以诱导神经元内早期TIMP-1的表达，但是在痫性发作始动期，其他因素即可影响神经元内TIMP-1的表达，稍后可影响其在胶质细胞的表达。这些因素包括前炎症细胞因子（如IL-1β，TNF-α）和碱性成纤维生长因子（bFGF），是可由痫性发作诱导并可能在损伤后参与组织修复的因子。TIMP-1，除了具有已被广泛认识的抑制MMPs的功能，还表现出神经营养活性。且由于痫性发作后细胞内短暂的TIMP-1表达，TIMP-1可能在神经细胞间营养作用的级联反应过程中有一定作用值得注意的是，TIMP-1的免疫反应在72h依然很强烈，且14d时在形态学类似星形胶质细胞的细胞中继续升高，这主要在脑的易损区如海马，杏仁核或内嗅区观察到。综上所述，痫性发作后，星形胶质细胞对脑组织重塑的作用，是基于它们引起细胞外基质成分改变的能力，也能通过调节MMPs/TIMPs的比例来调节它的转换。KA注射后2周，海马树突区和胶质细胞内仍可见到增强的TIMP-1的免疫反应，这一事实强有力的证明了，TIMP-1参与了痫性发作后组织重塑。综上所述，MMPs/TIMPs,以MMP-9/TIMP-1的研究较为明确，在KA注射后8h，在齿状回颗粒细胞表达增多。MMP-9的表达由胞体区（核周和近树突区）转移到树突区。TIMP-1在KA注射后8h，在神经元树突区和树突-轴突区反应增强；3d时，在胶质细胞和耐受性神经元如齿状回细胞的胞体及树突轴突区增强。脑易损区海马的CA1，TIMP-1表达缺乏，MMP-9表达亦不明显。另外，MMP-9在神经元中的表达是神经元活动依赖性的，而TIMP-1的表达是非神经元活动依赖性的。KA诱导的大鼠兴奋毒性发作过程中，神经元活动可诱导MMPs的表达升高，前炎症细胞因子参与调节神经元和胶质细胞表达MMPs/TIMPs，在不同时期，由不同部位的细胞表达。而且MMPs/TIMPs在细胞中的分布也发生改变，这可能是神经元及神经胶质细胞发生突触联系的基础。同时MMPs分解脑组织细胞外基质，MMPs/TIMPs分布不一致及比例失调，都参与了兴奋毒性诱导的痫性发作。小结MMPs/TIMPs，作为调节中枢神经系统细胞外基质的一个酶系，受多种因素的精细调节，保证了脑内环境的稳定。在某些致痫因子的的刺激下，MMPs／TIMPs的表达发生改变，与脑内免疫反应互相促进，共同参与了癫痫的发病过程。在症状性癫痫当致痫因子刺激机体时，机体发生免疫反应，免疫细胞在细胞因子的刺激下表达MMPs，MMPs和炎症反应通过不同的机制，都可使BBB通透性增加。BBB破坏后，激活了脑内的免疫反应，引起了脑损伤。免疫细胞表达MMPs/TIMPs，免疫反应同时激活了脑固有细胞表达MMPs/TIMPs，使其在脑内的表达水平提高。MMPs/TIMPs可通过其本身的生物学作用，降解脑的细胞外基质，打破脑内坏境的稳定，这可能影响了脑内某些信号通道的生理功能，如Ca2＋通道和Na＋通道。还可以影响神经元和神经胶质细胞树突重建，从而参与痫形放电环路的形成。癫痫作为一种临床常见疾病，其发病机制尚欠清楚，MMPs/TIMPs可能通过免疫机制参与其发病，但具体机制有待进一步研究。明确它们之间的关系，有利于临床上选择特异性MMPs的抑制因子，阻止痫性放电，从而治疗癫痫。参考文献[1]ZhouJh,StohlmanSA,AtkinsonR,etal.

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