分子实验操作误区

常规分子生物学实验操作误区及经验浅析报告内容实验过程中存在的主要问题1PaulSteven实验操作的经验漫谈3实验室常用材料的成本4PaulSteven实验室存在的实验误区2实验记录的电子化管理5一实验过程中存在的主要问题实验效率低1、实验前材料准备不足，导致实验过程中临时配置或购买某些必须材料，导致延误；2、实验理论、原理上把握不够，遇到问题不懂得分析原因，单纯地重复相同的操作，重复相同的错误。3、时间安排不够紧凑，实验过程中出现大量的“等待”时间，不懂得合理安排利用，仅仅是在手机屏幕与手指之间白白流逝掉。4、对实验不重视，操作过程中粗心随意，不按照标准操作进行，导致实验失败又重新进行。5、实验操作不熟练，动作较慢，错误较多。6、其他的一些原因。一实验过程中存在的主要问题实验效率低缺乏整体观念文献把握不够1、对自己的研究需要做哪些实验、做到什么程度可以讲出一个故事或者可以发表什么样的论文，没有概念。2、实验没有针对性，特别是表型检测及拿到突变体之后的实验，见别人在做什么就做什么，没有根据自己的材料的特点设计有针对性的检测实验。3、实验进展与原理把握不够，不能站在已发表的文献资料的原有平台上进一步提升自己研究的高度和深度。4、对自己的研究缺乏兴趣，缺乏信心，缺乏成就感，不明白自己课题的意义，缺乏主动探索的精神。一实验过程中存在的主要问题实验效率低缺乏整体观念文献把握不够材料浪费严重1、酶制剂使用过多、实验操作中样品使用过多；2、一次性塑料制品过多使用，导致白色污染；3、实验操作不规范，导致大量的重复实验；4、不懂得充分利用实验材料，如KIX板显色效果差了，可以用来转板而无需直接丢弃。二实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：操作粗犷、过于随意实验操作过于随意，对一切实验操作抱着无所谓的心理，不按照标准实验操作进行。①称量样品时随意，不擦拭样品匙，不考虑精确度，不在意样品的洒落；取琼脂粉时不称量，“大概”式添加。②做凝胶不按时收胶，凝胶在外面放置太久；电泳时不根据自己的样品大小选择某种浓度的琼脂糖凝胶；电泳时电压过高；电泳液长期不更换。③制备感受态的菌直接从-80℃冰箱或长期放置的平板上取出液体培养；制备过程中过多步骤没有在冰上操作；制备的感受态不进行验证就直接做转化实验。④挥发性材料没有在室外通风处或者室内的通风厨中取用。二实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：操作粗犷、过于随意实验操作过于随意，对一切实验操作抱着无所谓的心理，不按照标准实验操作进行。⑤因粗心大意、不认真而导致的样品取错、溶液配方看错、实验样品混淆（不认真做笔记）、加错试剂、看错实验条件等等情况常有发生，不一而足。⑥不认真做笔记，无论是各种反应的体系、溶剂配方还是某些关键实验操作，不做笔记或者仅仅是写在临时的纸片上，之后就遗失或遗忘了。⑦实验操作的台面“脏乱差”，只能在“夹缝中”进行实验操作，可能会使得很多未知的东西从桌面混入反应体系，影响实验。⑧超净台灭菌开着风机、不关死玻璃窗、里面的材料过多，存在较多的死角。⑨不注意某些缓冲液的pH值，感觉差不多就随意用。二实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：贪婪心理在实验中总觉得取用的材料不够，总认为多多益善，没有微量的概念，不能克服贪婪心理，不仅造成不必要的材料浪费，还会导致实验失败，浪费大量宝贵时间。①酶制剂取用过多。②菌体PCR时菌体取用过多。③电泳时上样量过多。④做PCR时，模板量如总DNA、总RNA添加过多。⑤提取总DNA或质粒时，总认为菌体越多越好。分子生物学实验中的哲学：做人勿贪！二实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：总怕染菌有些同学在做实验时总觉得超净台不够干净，总怕染菌，表现在以下几个方面。①超净台灭菌时间过长。②每次倒平板重新灭菌。③做感受态过程中样品离心过程中超净台反复灭菌。1、灭菌过程中产生的臭氧对人体有害、对马上进行操作的样品细胞有害；2、紫外灯寿命缩短，作用变弱，原本18分钟可以完成的灭菌，可能需要25分钟甚至更长。二实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：侥幸心理侥幸心理是分子生物实验中大家最容易犯的一种错误，无论是有经验的还是没经验的同学，都不例外。大家总是想省时间、省步骤以及对前一步实验的盲目自信是产生这种心理的主要原因。我们现用的绝多数分子生物学实验方法都是在分子生物学基础理论的基础上，辅以前人大量的实验经验而建立的，实验条件的细小改变，不一定会导致实验失败，但如果连续几个步骤都有细小的改变，积累起来常会出大错，而一旦出错了，往往不能够找到原因在哪里。所以，我们常常遇到一些莫名其妙的实验结果，无法用我们常识的知识去解释的结果。二实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：侥幸心理按照标准规范认真做好每一步操作，该进行检测和验证的，尽量不要省略。不要盲目、过分地相信经验！侥幸心理常有的表现：①质粒酶切后不电泳检测是否酶切完全；②测序时样品质量不过关，侥幸认为应该可以测的出来；③感受态细胞制备完以后不检测转化效率、不检测是否染菌就直接进行实验材料的转化；④互补时将基因片段不连接到小载体上测序，而是直接连接到互补的大质粒上测序；⑤提总DNA或质粒时不进活化的步骤，直接从-80℃冰箱取菌液体培养。⑥设计引物时忽略特异性比对的步骤，忽略二聚体等信息的分析步骤。二实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：不愿思考为什么很多同学在做实验时，容易出现两种情况：一是按照自己的意愿随意更改经典的实验操作，二是盲目相信往届毕业生的毕业论文中的实验方法。这两种情况的出现都是缺少必要的思考：该实验成败的关键点是什么？别人为什么这么操作？如果不这么操作会出现什么后果？哪些步骤是可以改良的？针对自己的具体实验，哪些步骤是不同的？二实验室存在的实验误区2、常见的不规范实验操作—A①不知道哪些药品需要灭菌，哪些不需要灭菌，如SDS溶液、NaOH溶液；不知道哪些可以高压灭菌，哪些需要低压灭菌。②PCR时不做正对照和负对照。③验证性PCR循环数过多。推荐25个循环。④PCR产物电泳上样量过多。推荐1ul-2ul。⑤电泳时很多泳道都加DNAmarker。⑥胶回收用的凝胶过厚。推荐使用80ml的打胶。⑦胶回收时用酒精灯烧切胶刀。推荐使用多个切胶刀。⑧胶回收用的凝胶中加入过多的GelRed。推荐0.8ulGelRed/100ml凝胶。⑨提质粒均用氯仿抽提。PCR验证、酶切验证用无需抽提。二实验室存在的实验误区2、常见的不规范实验操作—B①使用PCR仪时，随便更改他人的程序；②使用水浴锅后不关闭，特别是高温水浴；③使用各类仪器时，不看贴在旁边的使用操作说明。④倒平板时，不论各类平板，均倒13块。对于普通的转板、蓝白筛选等操作用的平板，推荐倒15-17块板/300ml培养基。三实验操作的经验质粒的提取常见问题与对策提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。经常会出现。2）两条带，超螺旋/闭环/开环任意两种。3）一条带，超螺旋。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了，进行分子克隆的操作，构建载体。这随便那种情况都可以，不会影响后续实验。进行细胞转染和测序，必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是：3）、2）、1）三实验操作的经验质粒的提取常见问题与对策质粒大小如何在电泳中的鉴定？酶切将质粒线性化以后，才可以用marker判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与marker比较判断大小。商品化的质粒估计应该大部分是超螺旋构像。酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小。三实验操作的经验质粒的提取常见问题与对策在保存或抽提DNA过程中，一般采用什么缓冲液？为什么？一般采用TE缓冲液。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。如下游有特殊需要也可用水保存DNA。我们一般直接进行下一步实验操作，无需考虑样品的存储问题，为避免可能带来的各类离子的干扰，常选用灭菌的去离子水溶解DNA。三实验操作的经验质粒的提取常见问题与对策抽提质粒DNA时，用酚、氯仿、异戊醇有什么作用？酚与氯仿是非极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，沉淀在水相下面与水相中的DNA分开。酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。为了混合均匀，必须剧烈振荡容器，易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。三实验操作的经验质粒的提取常见问题与对策在提取质粒时，是否可以不抽提蛋白质？我们常用的质粒或者重组质粒，基本都是在DH5α这类蛋白质较少的大肠杆菌中的，如果是需要送样测序，或者酶切后进行连接操作，建议用酚：氯仿进行抽提，如果仅仅是为了酶切验证重组质粒，则无需进行抽提。在加完溶液III后，离心取上清，再次离心，重新取上清加无水乙醇沉淀。两次离心可以去除绝大部分的不溶性蛋白质，在最后所得的质粒DNA中基本没有不溶性的物质出现。这种没有抽提的质粒完全可以满足胶回收、酶切验证等实验的要求。三实验操作的经验质粒的提取常见问题与对策在使用碱裂解法提取质粒时，加溶液III离心后出现一层白色的蛋白质漂浮物怎么办？两种解决方法：一是在加完溶液III后放在-20℃冰箱冰上10分钟，可以有效减少和杜绝蛋白质漂浮物；二是将这些上清液取出后再次离心，再次取上清，基本可以完全去除这些蛋白质漂浮物。三实验操作的经验其他方面的实验经验制备感受态的菌每次从-80℃冰箱取出活化，活化后再转接一次，然后再进行液体培养。菌体PCR，对于大肠杆菌只需用尖头的牙签碰一点点菌体便可。菌体PCR的体系，推荐10ul的体系，比20ul的体系减半。酶切的样品如重组质粒，不要一次性全部切完，要留一部分防止此次酶切失败而又要重新制备材料。三实验操作的经验其他方面的实验经验连接时，可以使用10ul的连接体系，使用不超过0.5ul的连接酶，不仅可以比使用5ul连接体系省酶，还可以在转化步骤有多余的连接体系备用。做转化时可以使用5ul的连接液转化，剩余的连接液放到-20℃冰箱暂存；如果因某些不确定性因素导致转化失败，可以用剩余的连接液再次转化。转化时如果转化液不完全涂布的话，最好剩余的转化液放到4°冰箱保存，直至确定本次转化可以挑选到自己所需的转化子；如果没有获得或者因某些因素导致本次涂布失败，可以用剩余的转化液重新涂布。三实验操作的经验其他方面的实验经验做PCR时8连管的标记做蓝白筛选时，37℃下培养17小时以上便可显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。用试剂盒提取质粒或者纯化DNA、胶回收时，最后一步加水或TEBuffer溶解和收集DNA时，可以将收集到的溶液再次放回柱子中离心一次，可以大大增加样品的浓度；也可以再次加新的水离心一次。普通的酶切验证，重组质粒取3ul，总体系用10ul，电泳时根据需要看看是否需要稀释，一般电泳1-2ul酶切体系便可，过多上样会导致电泳不整齐，不能准确地判断酶切片段的大小。四

常用到的部分材料成本试剂材料类琼脂糖1.5元/gGelRed1.2元/ul100bpMarker160元/支，0.3元/ul连接酶5元/ul

测序成本生工生物22元/反应华大基因20元/反应Invitrogen