化学物质的实验室分析技术-色谱-周倩如

职业卫生评价与检测第四章化学物质的实验室分析技术周倩如重庆市疾病预防控制中心

2014-5-13离子选择性电极法离子选择性电极法也称直接电位法，是利用膜电位把被测离子的活度表现为电极电位值，通过测定电极电位值来确定溶液中离子浓度的方法。离子选择电极的结构一般都是由敏感膜、内参比电极和内参比溶液组成。并且膜材料和内参比液中均含有与待测离子相同的离子，其中膜电位的产生机理是基于电极膜和溶液界面的离子交换作用。离子选择性电极法测量装置示意图2023/2/4当电极置于溶液中，在电极膜和溶液界面将发生离子交换及扩散作用，这就改变了两相界面原有的电荷分布，因而形成了双电层，产生了膜电位。由于内参比电极电位固定，内参比溶液的有关离子活度恒定，所以离子选择电极电位只随溶液中待测离子的活度变化而变化，并且两者关系符合能斯特方程。离子选择电极电位不能直接测出，通常是以离子选择性电极为指示电极，饱和甘汞电极作为参比电极，插入被测溶液中构成原电池，然后通过测量原电池电动势来求得被测离子的活度（或浓度）。在一定条件下原电池的电动势与被测离子活度的对数呈线性关系，通过测量原电池电动势，便可对被测离子进行定量测定。2023/2/4离子选择性电极法空气中氟化氢和氟化物用浸渍玻璃纤维滤纸采集，洗脱后，用离子选择电极测定氟离子的含量。样品处理：将采过样的滤纸放入塑料烧杯中，加入16ml

盐酸溶液和2ml水；用玻璃棒将滤纸捣碎，放入1

根铁芯塑料套搅拌子，于磁力搅拌器上搅拌3—5min，将滤纸打成浆状。供测定。若样品液中待测物的浓度超过测定范围，可用盐酸溶液稀释后测定，计算时乘以稀释倍数。样品测定：用测定标准系列的操作条件测定样品溶液和样品空白对照溶液。测得的样品电位值减去空白对照的电位值后，由标准曲线得氟的含量（μg）。处理后，向标准系列各杯加入1.3ml氨水溶液和2—3滴指示剂，在搅拌下用盐酸溶液和氨水溶液调节溶液呈蓝绿色。加5ml总离子强度缓冲液，插入氟电极及饱和甘汞电极，继续搅拌4—5min，停止后，测量溶液的电位（mV）值。再搅拌1—2min，停止后，再测量电位值（mv）。如此操作直至读数不变为止。2023/2/4氟化氢和氟化物的离子选择电极法注意事项终点判断：读数不变不是指到仪器的显示数值不变为止，而是根据IUPAC（国际纯粹与应用化学联合会）推荐响应时间定义，电位变化≤1mV/min时可认为响应达到平衡。重要的是，在标准液与样液测量中，应按完全一样的方式进行。氟电极的检测线性范围为为10-1-10-6mol/l，磷酸根、乙酸根、卤素离子、硝酸根离子、硫酸根离子和碳酸氢根离子均不干扰测定。Fe3+、Al3+、Be2+、Th4+等可与F-络合，使结果偏低。pH的影响：pH<5时，F-可与H+发生配位反应，使F-浓度降低，因此检测结果变低。当pH＞8时，OH-对电极的响应，将严重影响测定结果，使分析结果偏高。最佳检测pH为5—6。2023/2/4氟化氢和氟化物的离子选择电极法注意事项TISAB的作用：

掩蔽剂(通过络合反应掩蔽金属离子的干扰)离子强度调节剂(维持测试溶液的高离子强度状态)pH缓冲液(保证pH在5~6的范围内）甘汞电极的使用：甘汞电极的内溶液使用的是饱和氯化钾，作用是消除液接电位。试剂纯度的影响。氟电极有使用寿命，机械损伤、膜受到化学腐蚀均可影响其寿命。在正常情况下，氟电极的寿命为1—2年。2023/2/4氟化氢和氟化物的离子选择电极法什么叫色谱法？色谱法也称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。以气体为流动相的色谱法叫气相色谱法（GC），它利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。2023/2/4气相色谱法气相色谱分类：用固体吸附剂作固定相的叫气固色谱。气固色谱属于吸附色谱，它是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能差异进行分离。用液体（涂在固体担体上或毛细管壁上）作固定相的叫气液色谱。气液色谱属于分配色谱，它是利用不同组分在两相中分配系数不同进行分离。实际工作中，气液色谱的使用更广泛。气相色谱法的优点：分离效能高，选择性高，样品用量少，灵敏度高，应用范围广，分析操作简单快速。气相色谱法的缺点：定性能力差。2023/2/4气相色谱法气相色谱法的工作过程：待测物样品(气体或液体）注入到色谱柱顶端，由载气携带着通过色谱柱中固定相，使样品中各组分分离，然后分别进入检测器。检测器信号由电脑接收并处理，得到色谱图，通过对色谱图的处理，进而对样品中组分进行定性和定量分析。2023/2/4气相色谱法气相色谱分离原理：是利用试样中各组份在流动相和固定相间的分配系数不同，组份在两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，所以分配系数的差异是所有色谱分离的实质性原因。2023/2/4气相色谱法气相色谱图的一些基本术语2023/2/4气相色谱法气相色谱仪的构成：气相色谱仪基本结构通常由气路系统（载气、气体纯化器，减压阀）、进样系统（进样器、气化室）、分离系统（色谱柱）、控温系统、检测系统（检测器）、数据处理系统等组成。2023/2/4气相色谱法气路系统分离系统检测和数据处理系统进样系统温控系统载气进样口柱温箱检测器数据处理流量控制器气路系统：气源：作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯度高；价格便宜并易取得；能适合于所用的检测器。常用的载气有氢气、氮气、氩气、氦气、二氧化碳气等等。气体净化。气流控制：载气的流速不仅对色谱柱分离效率有重大影响，并且还决定分析所需要的时间。流速快，分析时间短；流速慢，分析时间增长。检测时，一般都有一个最佳流速，可以使柱子的分离效果最好。在实际工作中为了加快分析速度，选择的流速往往稍高于最佳流速，但不影响分离。气瓶的颜色：氮气空气—黑色、氢气—绿色、氦气—灰色2023/2/4气相色谱法-气路系统进样系统：作用是进样和使样品气化。在仪器上就表现为进样器和进样口。通常，载气的流量控制也是在进样口完成的。进样器：分为手动进样和自动进样。进样口：使样品瞬间气化而不分解。2023/2/4气相色谱法-气路系统玻璃棉的作用：进样衬管中填有玻璃棉，其作用是过滤样品中的杂质和增大比表面积，以达到帮助样品气化的作用。如果不使用玻璃棉，仪器的重现性将受到影响。但玻璃棉不宜填得太多，过多的玻璃棉可能会造成二次进样，甚至峰分叉。2023/2/4气相色谱法-气路系统气相色谱法不适用于沸点高于450℃的难挥发物质和热不稳定的物质。进样体积的选择。进样量过小可能会不能达到仪器的灵敏度；进样量过大峰会展宽，分离度会变小。在液体进样时还应考虑溶剂的气化体积。（下图为各种不同溶剂进样1μL的汽化体积(进样口温度250℃，载气压力140kPa）2023/2/4气相色谱法-气路系统异辛烷正已烷甲苯乙酸乙酯丙酮二氯甲烷二硫化碳乙腈甲醇水110uL140μL170μL185μL245μL285μL300μL350μL450μL1010μL分离系统由色谱柱组成，它是色谱仪的核心部件，其作用是分离样品。分为填充柱和毛细管柱。填充柱由不锈钢或玻璃材料制成，内装固定相，一般内径为2—4mm，长1—3m。毛细管柱又叫空心柱，分为涂壁，多孔层和涂载体空心柱。涂壁空心柱是将固定液均匀地涂在内径0.l—0.5mm的毛细管内壁而成，毛细管材料可以是不锈钢，玻璃或石英。现在使用最广泛的是石英毛细管柱。

2023/2/4气相色谱法-分离系统色谱柱长的选择：分辨率与柱长的平方根成正比。在其他条件不变的情况下为取得加倍的分辨率需有4倍的柱长。较短的柱子适于较简单的样品,尤其是由那些在结构、极性和挥发性上相差较大的组分组成的样品。但色谱柱越长，分析时间越长，分析效率降低。柱内径的选择：

柱径直接影响柱子的效率、保留特性和样品容量。小口径柱比大口径柱有更高柱效，但柱容量更小。液膜厚度的选择：液膜厚度影响柱子的保留特性和柱容量。厚度增加，保留也增加。薄液膜适合高沸点的化合物分析，厚液膜适合低沸点的化合物分析。固定相的选择：不同的固定相对不同的分析物的影响不同，根据相似相溶原理，性质越相近，固定相对其的流动阻力越大，其保留时间越长．色谱柱就是通过这个原理将不同性质的混合物相互分开的。2023/2/4气相色谱法-分离系统色谱柱的维护：老化柱子

溶剂清洗

除掉柱入口污染的部分

2023/2/4气相色谱法-分离系统进样口温度:

考虑样品中各组分的沸点，设定温度使样品瞬间汽化。色谱柱温度:柱温不得高于固定液的最高使用温度，否则固定液会因挥发而流失。在保持较好分离度的前提下，对最难分离的物质应尽可能再用较高柱温，但以保留时间适宜、峰型不拖尾为度。柱温升高，柱效升高，但如果柱温过高，会影响柱子的分离度。但柱温太低，会使峰形变宽、柱效下降、并延长了分析时间。柱温的选择还须从试样沸点和固定液配比综合考虑。柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。对于组分复杂、沸程宽的试样，采用程序升温的方法，使低沸点和高沸点样品都能达到良好的分离。检测器温度:

防止检测器污染，一般比色谱柱温度高20-30℃。DET.T≥INJ.T≥COL.T+20℃2023/2/4气相色谱法-温控系统氢火焰离子化检测器：

以氢气和空气燃烧的火焰作为能源，含碳有机物在火焰中燃烧产生离子化介质和电子，在火焰燃烧处和收集极（电极）上加一电压，带电粒子被收集极吸引和捕获形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。

离子数目正比于碳原子数目(C-H键)。

一些官能团如羰基(CO=)、羟基(－OH）、卤素（－X）、胺（NH4+）则很少或根本不会离子化。对无机气体如H2O,CO2,SO2,和NOx不灵敏。

检测器温度应比柱温箱设定的最高温度高30C，且大于150C以防止水凝结在检测器上。2023/2/4气相色谱法-检测系统电子捕获检测器

电子捕获检测器内有一个放射源（Ni63放射源）作为负极，还有一正极。两极间加适当电压。当载气(N2)进入检测器时，受放射源不断放出β粒子射线的辐照发生电离，生成的正离子和电子分别向负极和正极移动，形成恒定的基流。

含有电负性元素的样品进入检测器后，就会捕获慢速低能量电子而生成稳定的负离子。

生成的负离子又与大量存在于周围的载气正离子复合。结果导致基流下降，形成负峰。经过转换处理，形成色谱峰。ECD检测器对卤素、过氧化物、醌类金属有机物及硝基化合物非常灵敏。而对胺类、醇类及碳氢化合物不灵敏。灵敏度高，检测限可达10-14g/ml，但线性范围较窄。

使用注意事项：忌水、忌氧，忌使用含氯物质作为溶剂（如氯仿）。

2023/2/4气相色谱法-检测系统保留时间定性在一定的色谱系统和操作条件下，每种物质都有一定的保留时间，如果在相同色谱条件下，未知物的保留时间与标准物质相同，则可初步认为它们为同一物质。用不同检测方法定性同一样品可以采用多种检测方法检测，如果待测组分和标准物在不同的检测器上有相同的响应行为，则可初步判断两者是同一种物质。

与其他仪器联用定性将具有定性能力的分析仪器如质谱（MS）、红外（IR）、原子吸收光谱（AAS）、原子发射光谱（AES和ICP-MS）等仪器作为色谱仪的检测器即可获得比较准确的定性信息。

注：时间带的运用！2023/2/4气相色谱法-定性方法色谱定量分析的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进行定量分析。职业病危害因素检测检验定量分析一般采用标准曲线法。标准曲线法，亦称外标法。首先用纯物质配制一系列不同浓度的标准试样，在一定的色谱条件下准确定量进样，测量峰面积（或峰高），绘制标准曲线。

进行样品测定时，要在与绘制标准曲线完全相同的色谱条件下准确进样，根据所得的峰面积（或峰高），从曲线查出被测组分的含量。外标法不使用校正因子，准确性较高，操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。2023/2/4气相色谱法-定量方法原理：用活性炭管采集工作场所空气中的苯，用二硫化碳解吸，经色谱柱分离，氢焰离子化检测器检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。样品处理：将采过样的前后段活性炭分别放入容积解析瓶中，各加入1.0mL二硫化碳，塞紧管塞，振摇1min，解析30min。解析液供测定。注意事项：二硫化碳的纯度。标准溶液的配制。2023/2/4气相色谱法-苯的溶剂解吸法高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器的新型分离分析技术。分离原理与气相色谱法类似，都是根据不同组分在两相间的分配系数不同进行分离。高效液相色谱的流动相是液体，因此适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定差的化合物分离。高效液相色谱法的优点：分离效能高、选择性好、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广。高效液相色谱法的局限性：有机试剂成本高，毒性大；

缺少通用型检测器；不能替代中低、压柱色谱法。2023/2/4高效液相色谱法根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、体积排阻色谱和亲和色谱。2023/2/4高效液相色谱法高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和色谱数据处理系统（色谱工作站）五个基本部分和相关辅助部件构成。2023/2/4高效液相色谱法高压输液系统由储液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。进样系统：隔膜式注射进样器和六通阀进样。分离系统：色谱柱、柱温箱和连接管。2023/2/4高效液相色谱法色谱柱由柱管、填料、密封圈、过滤板、柱头等组成。应特别注意柱头规格及无死体积连接的特性。2023/2/4高效液相色谱法—色谱柱色谱柱的使用注意点：避免柱压过高（根据不同的柱子要求不同）。柱温在40℃左右,一般不超过50℃。色谱柱的方向性。一般ODS柱流动相PH使用范围为2—7.5。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。样品进样前必须经过微孔膜过滤。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。如果用缓冲溶液作为流动相，分析结束时必须先用纯水冲洗10分钟，再用甲醇-水冲洗，绝不能让缓冲溶夜留在柱子中过夜。使用保护柱可延长柱子寿命。保护柱应经常更换。2023/2/4高效液相色谱法—色谱柱柱温箱的作用：控制温度，保证分析结果重现性。升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性。2023/2/4高效液相色谱法—柱温箱检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分定量转变为电信号。紫外可见检测器：

原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收

优点：1）对温度和流速变化不敏感

2）可用于梯度分析

缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质荧光检测器：

原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测

优点：1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一

2）选择性好

3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱

缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质2023/2/4高效液相色谱法—检测器在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。正相液-液分配分离：先选中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2023/2/4高效液相色谱法—流动相流动相使用的注意事项使用的溶剂必须是HPLC级别的，水最好是18.2MΩ的超纯水。使用前应使用0.45μm或更小孔径滤膜过滤，目的是除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液时。脱气，目的是除去流动相中因溶解或混合而产生的气泡。使用了缓冲盐的流动相应当天配制。2023/2/4高效液相色谱法—流动相原理：空气中五氯酚用微孔滤膜与乙二醇吸收液串联采样，经C18色谱柱分离,紫外检测器检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。样品检测：将采样后的吸收液摇匀，吸收液定量转移至具塞试管中，用甲醇洗涤吸收管及微孔滤膜，并定容至10.0mL，摇匀，供测定。2023/2/4酚类化合物的五氯酚及其钠盐的高效液相色谱法离子色谱法（IC）是利用色谱技术测定水溶液中带正电荷或负电荷的离子态物质的方法，属高效液相色谱法的一种。根据分离机理不同，离子色谱（IC）可分为离子交换色谱（HPIC）、离子排斥色谱（HPIEC）和离子对色谱（MPIC）三种。离子色谱法的优点：分析过程快速、方便灵敏度高选择性好可同时分析多种离子化合物运行费用非常低，无需特殊试剂分离柱的稳定性好，容量高2023/2/4离子色谱法分离方式选择：首先应了解待测化合物的分子结构和性质以及样品的基体情况，如无机还是有机离子，离子的电荷数，是酸还是碱，亲水还是疏水，是否为表面活性化合物等。待测离子的疏水性和水合能是决定选用何种分离方式的主要因素。水合能高和疏水性弱的离子，如Cl-或K+，最好用离子交换分离。水合能低和疏水性强的离子，如高氯酸（ClO4-）或四丁基铵，最好用亲水性强的