第一讲细胞生物学

细胞生物学细胞生物学研究方法汤薇陕西师范大学2013中学生物学骨干教师专业培训

细胞形态结构的观察方法

细胞组分的分析方法

细胞培养、细胞工程用于细胞生物学研究的模式生物细胞生物学研究方法

光学显微镜技术（lightmicroscopy）

电子显微镜技术

(Electromicroscopy)

扫描探针显微镜（ScanningProbeMicroscope）

扫描遂道显微镜

(scanningtunnelingmicroscope)

原子力显微镜（atomicforcemicroscope）

细胞形态结构的观察方法

离心分离技术

细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法

特异蛋白抗原的定位与定性

细胞内特异核酸的定位与定性

放射自显影技术

定量细胞化学分析技术细胞电泳细胞组分的分析方法细胞的培养

细胞工程

细胞培养、细胞工程技术

普通复式光学显微镜技术（

lightmicroscopy）

荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）

倒置显微镜（invertedmicroscope）相差显微镜（phase-contrastmicroscope）微分干涉显微镜（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）

光学显微镜技术（lightmicroscopy)电子显微镜的基本知识电镜的基本构造电镜与光镜的比较电子显微镜的主要类型扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）

透射电镜（Transmissionelectronmicroscope，TEM）

主要电镜制样技术

电子显微镜技术

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离普通复式光学显微镜技术1600倍是光学显微镜放大倍率的最高极限光学显微镜是一种以可见光为光源利用光学透镜产生影像放大效应的显微镜。ABDCEFHGFas蛋白免疫组化染色（400倍）原理与应用

直接荧光标记技术

间接免疫荧光标记技术

用于特异蛋白质等生物大分子的

定性定位：绿色荧光蛋白(GFP)的应用

荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）荧光显微镜是以紫外光为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。ABCFEHDGAnnexinV-FITC-PI染色（400倍）免疫荧光技术标记细胞骨架绿荧光水母——通过体内绿色荧光蛋白发光科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质2008年的诺贝尔化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。

激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。原理特点： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构样品的三维结构。激光共聚焦扫描显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）P53蛋白在细胞内位置变化串叶松香草作者：Shirley

Owens；城市：美国法拉盛；技术：激光扫描共聚焦。倒置显微镜InvertedMicroscope

组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。贴壁培养细胞观察悬浮培养细胞观察相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究

活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动电镜与光镜主要结构性能的比较

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差主要由4部分组成电子束照明系统；成像系统；真空系统；记录系统。

扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。目前扫描电镜的分辨力为6～10nm。

/人类血细胞SEM照片扫描电镜观察的花粉粒JEM-1011透射电子显微镜

透射电镜的总体工作原理是：由电子枪发射出来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上；透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多；电子束进行综合放大成像，将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察。目前TEM的分辨力可达0.2nm

。高尔基体透射电镜图（伪彩色）

超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图

负染色技术与金属投影

染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（技术示意图）

冰冻断裂与蚀刻复型：观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。

快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）电镜三维重构技术

电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。它与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。主要电镜制样技术

扫描隧道显微镜

扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）由Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。

用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物

差速离心：分离密度不同的细胞组分差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离

用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用使细胞组分分层、分离。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。离心分离技术

原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些

特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

方法：FeulgenStaining等

细胞内核酸、蛋白质、

酶、糖与脂类等的显示方法

1.Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。

2.金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。

3.偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。4.联苯胺反应：过氧化物酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

5.普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。

6.

Formazane反应：显示脱氢酶。

7.

吲哚酚反应

（Nadi反应）：显示细胞色素氧化酶。

8.

脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

9.

茚三酮反应：显示蛋白质。

免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限

蛋白电泳(SDS)与免疫印迹反应(Western-Blot)

免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术特异蛋白抗原的定位与定性根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明等。酶标记的称为酶标免疫法，常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。免疫荧光技术标记细胞骨架蛋白质电泳和转膜仪器电泳后凝胶经考马斯亮蓝染色转膜后经X射线胶片曝光

光镜水平的原位杂交技术

（同位素标记或荧光素标记的探针）

电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）

核酸体外扩增技术

细胞内特异核酸的定位与定性核酸体外扩增技术1.非等温扩增——PCRPCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。2.等温扩增——LAMP环介导等温扩增技术，与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：(1)操作简单：不需要特殊的试剂及仪器。(2)快速高效：因为不需要预先的双链DNA热变性，多数情况在15-60min即可完成。(3)高特异性：由于设计4种特异性引物，引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。(4)高灵敏度：比PCR高出数量级的差异。PCR后琼脂糖凝胶电泳结果实时荧光定量PCR仪记录结果原理及应用：将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）

放射自显影技术将显微镜技术与分光光度计结合起来的技术。它以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测定基础，可用来分析生物样品细微结构中的化学成分，同时进行定位、定性和定量。

细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。

紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法

流式细胞术（FlowCytometry）主要应用：定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。

定量细胞化学分析技术流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术，所用仪器称为流式细胞仪（flowcytometer）。流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦后垂直照射在样品流（单个细胞的液滴）上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。根据采集到的信号把特定的细胞或细胞器从群体中分类收集。

流式细胞术结果表示方式：散点图，直方图，密度图，三维图，等高图散点图直方图

细胞电泳

在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（cellelectrophoresis）。引起细胞电泳的电位值称为ξ电位。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的ξ电位。ξ电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。此外由于不同类型的细胞在电场中的泳动速度不同，细胞电泳尚可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。单细胞凝胶电泳技术（彗星电泳）

动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primaryculturecell）

从动物机体取出的进行培养的细胞群。

继代\传代培养细胞（sub-culturecell）

将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶。 细胞株（cellstrain）正常二倍体，接触抑制细胞系（cellline）亚二倍体，接触抑制丧失

植物细胞培养

类型：原生质体培养（体细胞培养）

单倍体细胞培养（花药培养）非细胞体系（cell-freesystem）来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质组成的体系。

细胞的培养

动物细胞培养

细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养，将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；另一种是克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。

Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养

植物细胞培养1．组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株。用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。

2．悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。

3．单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。4．原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体，与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。核糖体体外组装DNA杂交细胞融合（cellfusion）技术通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交（cellhybridization）。单克隆抗体技术（monocloneantibody）显微操作技术（micromanipulationtechnique）

在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（micromanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞工程