LC日常维护和故障处理

日常维护和常见色谱故障Page2711溶剂准备：过滤防止固体颗粒损伤仪器或柱头使用小于0.5

m过滤膜.有机物-Teflon水

-Nylon66使用HPLC纯溶剂过滤装置真空2溶剂过滤不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵的操作性能。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命：使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。用滤膜过滤溶剂去除微生物。每两天更换或过滤溶剂。避免溶剂瓶直接日照。3溶剂信息避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。在有机溶剂中的有机酸溶液。含有强络合剂的溶液。四氯化碳和异丙醇或THF混合液。4NameAceticAcidAcetoneAcetonitrileBenzeneButylAlcoholCarbonTetrachlorideChloroformCyclohexaneCyclopentaneDichloroethaneDichloromethaneDimethylformamideDimethylSulfoxideDioxanEthylacetateEthylAlcoholDi-EthyletherHeptaneHexaneMethylAlcoholMethylethylKetoneI-OctanePentaneI-PropylAlcoholTetrachloroethaneTetrahydrofuranTolueneAceticAcidAcetoneAcetonitrileBenzeneCarbonTetChloroformCyclopentaneButylAlcoholCyclohexaneDichloroethaneCHCl22DMFDMSODioxanEthylacetateEthylAlcoholDi-EthyletherHeptaneHexaneMethylAlcoholMEKI-OctanePentaneI-PropylAlcoholDi-PropyletherCH22Cl4THFTolueneTrichloroethaneWaterXyleneTrichloroethaneWaterXyleneDi-PropyletherImmiscibleMiscible溶剂的相溶性5溶剂的紫外吸收SolventUVCutoff(nm)Acetonitrile190WaterCyclohexane195Hexane200Methanol210Ethanol210DiethylEther220Dichloromethane220Chloroform190240CarbonTetrachloride265Tetrahydrofuran280(210)Toluene280UVCutoffisthewavelengthatwhichabsorbanceequals1AU.6溶剂脱气目的脱气方法He脱气排除溶解在流动相中的氧气和氮气回流加热脱气真空脱气超声脱气7准备流动相流动相应该：HPLC级过滤(最大0.45um,0.2um最好)脱气，尤其在低流速时相溶8初始化HPLC泵移走溶剂与系统中的气泡使溶剂组成变化更容易确保分析结果再现性对于反相柱使用5～10倍柱体积流动相平衡色谱柱Flow柱平衡初始化和平衡9预柱和保护柱从泵来的流动相预柱进样口保护柱分析柱至检测器预柱是针对流动相来保护色谱柱

保护柱是针对样品来保护色谱柱10ColumnInstallation柱安装Eachcolumnhasadefinedflowdirection!Theflowdirectionisshownbythearrowordirectionofwriting.Don’tchangetheflowdirection,thiswilldecreasecolumnperformance.每根柱子都定义一个流动方向.这个流动方向用箭头或其他方式显示在柱子上.不要改变随意改变流动方向,这将降低柱性能.11ColumnInstallationWhat’sneeded:Therightconnectorstoavoidanyfutureleak.GuardcolumntoprotectthemaincolumnTherighttools12ColumnInstallationcont.Practicalhints:Fingertighten1/4turnwithwrench13色谱柱保护过滤所有的溶剂和样品使用保护柱仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液柱子在不使用时，两端密封保存在适当的溶剂中保存柱子注意色谱柱的pH值使用范围不要高压冲洗柱子不要高温下过长时间使用硅胶键合相14样品准备样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，确保样品中不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小15HPLC柱测试对于一根新柱子，在流动相组成不变的情况下进行下述实验并记录：1.记录理论塔板数N，以及:柱子长度及内径.测试样品名称及K’值.固定相和流动相.流动相流速.进样量.温度.2.峰对称性包括苯酚胺3.记录柱子压力.16TheGoodUser下列优良/常规实验操作能够最大限度降低维修费用：清洁的仪器,流动相和样品;如果必要,进行过滤。保证溶剂的相溶性。仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。对仪器的维护和保养进行记录。17混合问题问题：一个有紫外吸收的流动相与一个没有紫外吸收的流动相动态混合产生噪音，增加静态混合器可以降低这种噪音。缺点:

增加了死体积++静态混合器18基线噪音可能的原因：检测池脏检测器氘灯能量下降由泵引起的脉冲检测器上的温度效应检测池中有气泡通过Time(min.)19基线噪音

停泵

噪音是否依然存在是否检测器?泵或流动相?

其它要考虑的问题▲是否改变了流动相的组成？▲是否改变了检测波长?▲在你的仪器上使用的最后的流动相是什么?▲流动相是否相溶?▲流动相是否干净?20基线漂移梯度洗脱引起的温度不稳定（RID）流动相脏柱子没有用流动相平衡系统中污染物溢出21鬼峰20%-100%MeOH梯度洗脱没有进样鬼峰－没有进样就有色谱峰出现。原因－流动相脏60153015037151722柱外扩展用较短的、窄内径的毛细管连接进样器和色谱柱以及柱子和检测器。确认连接管的接头都相互匹配。使用死体积小的流动池减小进样量增加柱外死体积23峰形柱头塌陷或柱床运动。泵头过滤芯(Frit)部分堵塞。组份共流出1·双峰正常双峰柱头塌陷24峰形2·峰扩展所有峰都扩展柱效降低或有柱塌陷进样体积过大流动相粘度大部分峰扩展前一次分析样品的流出物高分子量样品－蛋白质或聚合物25峰形原因：部分峰拖尾正常拖尾正常拖尾二次保留效应残留硅醇的相互作用小峰在大峰后洗脱出来3·拖尾对称因子>1.2柱头有污染物堆积重金属反应所有峰均拖尾柱外效应柱子失效26峰对称ABS=BAExcellentS=1.0-1.05AcceptableS=1.2UnacceptableS=2AwfulS=427拖尾因子t=A+B2AABExcellentt=1.0-1.05Acceptablet=1.2Unacceptablet=2Awfult=428峰形原因：正常前伸柱子过载4·前伸峰小峰在大峰之前洗脱出来对称因子<0.929峰形原因正常负峰样品吸收比流动相吸收小。5·负峰溶解样品的溶剂通过柱子时平衡被破坏RID中最常见30六通阀手动进样阀-六通阀ToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFromPumpToWasteCommonProblemsImpropersyringesizeortypeValveBlockageInjection-portleakageSamplecarryoverCross-portleaks31压力问题

压力问题压力过高压力过低压力波动???32压力过高

柱子进口过滤芯被污染PURGE阀过滤芯被污染

色谱柱被污染

连接管路，尤其是针座毛细管堵塞

进样器旋转密封阀被堵塞

进样针或针座被阻塞

压力测量使用此阀分割系统33监测高压34溶剂进口过滤芯堵塞连接管路泄漏或其它备件（泵密封