分子发光光谱法(福大仪器分析)

第4章分子发光光谱法分子发光的类型-按激发的模式分类：光致发光：分子吸收光能被激发，所产生的发光：分子荧光和磷光化学发光：分子由化学反应的化学能所激发生物发光：分子由生物体体内的化学反应释放出来的能量所激发分子发光分析法的特点

灵敏度高。较吸收光度法一般要高2~3个数量级。选择性比较高。样品量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。4.1荧光与磷光的基本原理第4章分子发光光谱法4.1.1分子荧光与磷光的产生

分子能级：电子能级、振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1

、S2…；第一、第二、…电子激发三重态T1

、T2…；4.1荧光与磷光的基本原理第4章分子发光光谱法4.1.1分子荧光与磷光的产生

电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；

S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；

第4章分子发光光谱法4.1.1分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程非辐射能量传递过程

（1）振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。

（2）内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。

第4章分子发光光谱法4.1.1分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程非辐射能量传递过程

（3）外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。（4）系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁（S1T1)。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。第4章分子发光光谱法4.1.1分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程辐射能量传递过程

(1)荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9s。

由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；‘2>2>1第4章分子发光光谱法4.1.1分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程辐射能量传递过程

(2)磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）

S0→激发→振动弛豫→内转换→系间跨越→振动弛豫→T1

发光速度很慢：10-3～10s。

光照停止后，可持续一段时间。第4章分子发光光谱法4.1.2荧光量子效率荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。第4章分子发光光谱法4.1.3荧光的激发光谱和发射光谱1.荧光(磷光)的激发光谱曲线

固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。2.荧光光谱(或磷光光谱)

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。第4章分子发光光谱法4.1.4荧光光谱的特征

1.Stokes位移

激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

第4章分子发光光谱法4.1.4荧光光谱的特征2.

镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。第4章分子发光光谱法4.1.4荧光光谱的特征3.发射光谱的形状与激发波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。

第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-分子结构第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-分子结构（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-分子结构（4）取代基效应：第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-分子结构（4）取代基效应：P316/表14.1第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-环境因素（1）溶剂的影响

除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-环境因素（1）溶剂的影响（2）温度的影响（荧光强度对温度变化敏感）第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-环境因素（1）溶剂的影响（2）温度的影响（3）溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；（4）猝灭

发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强度下降的物理或化学作用过程。第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-环境因素（4）猝灭

发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强度下降的物理或化学作用过程。与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质，称为猝灭剂（如氧,一般需除氧）。动态猝灭：猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用静态猝灭：猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用第4章分子发光光谱法4.1.5影响荧光强度的因素-环境因素（5）内滤作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱

的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光,如色胺酸中的重铬酸钾；第4章分子发光光谱法4.2分子荧光光谱仪激发光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)样品池：石英池双单色器系统：激发单色器（选择激发光波长）；

发射单色器（选择发射光(测量)波长）检测器：光电倍增管。

第4章分子发光光谱法4.3分子荧光光谱法的应用（1）灵敏度高

比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级检测下限：0.1～0.001g/cm3（2）选择性强

既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少

缺点：应用范围小。第4章分子发光光谱法4.3.1荧光定量分析荧光强度

If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：

If=Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-bc)If=I0(1-10-bc)=I0(1-e-2.303bc)

浓度很低时，将括号项近似处理后：

If=2.303I0bc

=Kc4.3.1.1荧光强度与浓度的基本关系式第4章分子发光光谱法4.3.1.2单组分的荧光直接测定和间接测定1.直接测定法

要求被分析物本身具有荧光。通常采用相对测量方法，如工作曲线法。每次测绘工作曲线最好用同一种稳定的荧光物质校准仪器的读数。2.间接测定法被分析物本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。如：光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等第4章分子发光光谱法4.3.1.2单组分的荧光直接测定和间接测定(1)无机化合物与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析（见表）第4章分子发光光谱法4.3.1.2单组分的荧光直接测定和间接测定第4章分子发光光谱法4.3.1.2单组分的荧光直接测定和间接测定第4章分子发光光谱法4.3.1.3多组分的荧光测定第4章分子发光光谱法4.4磷光光谱法

磷光发射：T1→S0跃迁；

S0→激发→振动弛豫→内转换

→系间跨越→振动弛豫→T1

发光速度很慢：10-3～10s

光照停止后，可持续一段时间

荧光发射：

S1→S0跃迁；

10-7～10-9s

第4章分子发光光谱法4.4.1低温磷光

由于三重态寿命较长，为减小非辐射失活过程的影响，通常应在低温条件下测量磷光。

液氮是最常用的冷却剂，因而要求所使用的溶剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易制备和提纯。

第4章分子发光光谱法4.4.2室温磷光

固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭作用，显示室温磷光。

胶束稳定的室温磷光分析：磷光体进入表面活性剂的胶束溶液中，微环境和定向约束力发生变化，减小内转化和碰撞能量损失等非辐射失活过程概率，明显增大三重态的稳定性，使磷光强度显著增大。

敏化室温磷光分析第4章分子发光光谱法4.4.3磷光分析仪

荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。

测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。第4章分子发光光谱法4.4.4磷光分析的应用第4章分子发光光谱法4.4.4磷光分析的应用第4章分子发光光谱法4.5化学发光分析

化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光辐射。生物发光是指产生于生物体系中的化学发光。基于这类发光现象的分析方法，称为化学发光（或生物发光）分析法。

优点：(1).灵敏度很高。(2).仪器设备简单，无须光源和单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3).线性范围宽；(4).分析速度快。

局限：目前可供应用的发光体系尚有限，发光机理有待进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。

第4章分子发光光谱法

在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；

化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。4.5.1化学发光分析原理第4章分子发光光谱法4.5.2化学发光反应类型1.直接化学发光A+B=C*+DC*

→C+h第4章分子发光光谱法4.5.2化学发光反应类型2.间接化学发光第4章分子发光光谱法4.5.2化学发光反应类型3.液相化学发光

发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；光泽精等

该发光反应速度慢，某些金属离子（如Fe2+,Cu2+

等）可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。鲁米诺在碱性溶液