RNAi技术在作物品质改良中的应用

RNAi技术在作物品质改良中的应用延安大学生命科学学院陈国梁瑞典卡罗林斯卡医学院2006年10月2日宣布，将2006年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了RNA(核糖核酸)干扰（interference

）机制。

AndrewZ.FireCraigC.MelloFire生于1959年，现在是美国斯坦福大学遗传学和病理学教授。Mello出生1960年目前在美国马萨诸塞大学医学院任教。1998年，他们在《自然》杂志上共同发表论文宣布，他们发现了RNA具有可以干扰基因的机制。Mello在家中接到诺贝尔奖评审委员会电话的时是当地时间4时40分左右。他感到“非常惊讶”，“到现在还没回过神来”。他说：“我有预感可能得奖，但我才45岁啊，原本以为10年或20年后才会得奖呢。”Fire在接受媒体采访时则说，获奖的感觉真是非常美妙，“一开始，我都不敢相信，它也许是个梦，或者有人搞错了，但又想这不可能。能获奖真是太棒了！”《Science》周刊2001，2002，2003，2004年连续四年将“非编码RNA”等评选为该年度全球科学十大进展，而2002年更将其作为进展的第一位。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年后，这项技术的始作俑者，Fire和

Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。在评审委员会的公报中称：“他们的发现澄清了许多令人迷惑和矛盾的实验结果，揭开了大自然控制遗传信息流动的一种机制，他们开创了一个崭新的研究领域”；“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。这些都表明小RNA的研究已引起国际上的广泛关注，并且引领着生命及医学领域前沿课题的研究。小RNA的出现以及RNA干涉现象的发现重新唤起了科学家们对“RNA世界”的重视及对“生命起源于RNA分子”这一命题的兴趣。那么，什么是RNA干扰？反义RNA技术：指利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其体外或体内表达反义RNA，从而抑制靶基因的表达。①与前mRNA结合，影响mRNA的成熟和在胞浆内转运；②与相应的靶RNA结合从而激活RNase,加速靶RNA的降解；③直接与起始密码子AUG结合而阻止转录的启动；④互补作用于SD编码区的反义RNA可阻止核糖体在mRNA上的移动。蛋白质mRNADNA1RNAi是如何发现的？1.1加深矮牵牛花的紫色

1990，Jorgensenetal；材料：牵牛花；目的：得到紫色更深的花；方法：构建由强启动子启动的查耳酮合酶基因表达载体，导入牵牛花；结果：杂色花或花变得更白；分析：内源和外源的查耳酮合酶基因的表达都被抑制。称之为共抑制（co-suppression）。1.2

提高红面包霉菌的橘色色素含量90年代中期；材料：红面包霉菌；目的：提高红面包霉菌的橘色色素含量；方法：额外转入与类胡萝卜色素生产相关之基因，提高该基因内生存在之拷贝数；结果：却发现大约有三分之一的霉菌无法产生色素，呈现白色，而不是深橘色；分析：内源和外源的基因的表达都被抑制。1.3阻断秀丽新小杆线虫的par-1基因

1995，GuoSuetal材料：线虫；目的：消除线虫第一次分裂的不对称性；方法：利用反义技术抑制par-l的表达。同时也注入正义RNA以期观察到基因表达的增强；结果：两种方法都抑制par-l基因；分析：这是与当时理论相矛盾，无法解释，该研究小组一直没能给这个意外以合理解释；1.4阻断秀丽新小杆线虫的par-1基因

1998，Fireetal材料：线虫；目的：消除线虫第一次分裂的不对称性；

方法：注射经过纯化的由T4和T7RNA聚合酶体外转录得到的ss-RNA；注射经过纯化后的dsRNA；结果：ss-RNA只引起微弱的抑制作用；dsRNA却得到比前者高两个数量级的抑制效果；分析：RNAInterference(RNAi)，Nature，1998，391:806-811；2

RNAi现象的普遍性在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

3什么是RNAiRNA干扰（RNAinterference，RNAi），或称RNA干涉，是由内源性或外源性双链RNA引起的序列特异性基因沉默。小分子双链RNA能对基因的表达的不同层次进行调控，即转录水平的基因沉默（主要体现在siRNA修饰DNA分子，抑制转录的发生）和转录后水平基因沉默（主要指siRNA在mRNA水平抑制目标基因表达），来调节或关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。4RNAi作用过程（1）起始步骤

dsRNA的形成dsRNA切成siRNARNA诱导的沉默复合物（RISC）的形成（2）作用步骤

RISC中的siRNA可与序列互补的特定mRNA识别，之后，mRNA与dsRNA的一条链发生链互换，从酶-dsRNA复合物中释放出来。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21～23bp长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，达到抑制表现的效果。5RNAi的作用类型

针对DNA分子在转录水平

针对mRNA在转录后水平RNA介导DNA的甲基化

RNA介导的异染色质形成RNA介导的DNA分子消融siRNA在mRNA水平抑制目标基因表达普遍性

高效性特异性

可传播性

扩散性

位置效应

RNAi的特点6RNAi的特点7RNAi技术在作物品质改良中的应用

7.1利用RNAi调控某一物质含量以提高作物品质高油酸油有其重要意义:一是高油酸菜油是一种健康营养油，可降低人体动脉血管中低密度脂蛋白的含量，而对高密度脂蛋白含量则没有影响，从而减少胆固醇的形成，有效预防人体心血管疾病；二是高油酸菜油较耐贮藏，货架期较长；三是高油酸菜油能有效进行甲酯化，有利于生产生物柴油。因此，利用转录后水平的RNA干扰技术同时抑制这两个酶基因的表达，希望通过这种方式提高油料作物的油酸和芥酸的含量，提高其营养价值。油酸油酸脱氢酶（FAD2）亚油酸油酸脂肪酸延长酶(FAE1)芥酸利用RNAi沉默技术抑制油菜油酸脱氢酶（FAD2）使甘蓝型油菜和芥菜型油菜中的油酸含量分别升高到89%和75%棉花的FAD2将棉花籽油中硬脂酸含量从非转基因的2%～3%提高到40%，油酸含量从15%提高到77%。7.2改良淀粉品质

淀粉是重要的工业原料，但是生产不同产品所需淀粉种类有所差别，如何针对工业生产所需来提高作物某一类淀粉的含量以降低原料纯化的成本，而利用RNAi技术改变代谢的物质流方向，来提高工业加工原料在作物中的含量，无疑是一种十分有效的方法。利用RNAi技术抑制得到总淀粉含量与对照之间基本没有差异，但直链淀粉的含量提高了约50%的转基因玉米植株培育出低直链淀粉含量的转基因红薯个体;获得了直链淀粉含量明显下降的小麦植株;玉米淀粉分支酶(SBE)直链淀粉合成的关键酶(Waxy基因)籽粒直链淀粉含量提高到70%以上小麦SBEⅡa

和SBEⅡb基因7.3提高营养物质植物产品为人们的生产生活提供了必要的物质基础，然而一些作物中的某些物质对人类的健康有害或对某些人群有不良反应，有些又是有利于人类健康。于是人们开始利用RNAi技术提高营养物质或降低有害物质含量研究，为人类提供更健康、更个性化的产品。番茄DET1基因番茄红素B2环化酶（Lcy）基因利用RNAi技术抑制提高了番茄类胡萝卜素和黄酮醇这两种营养物质的含量，而果实的其它营养品质却没有很大改变。转基因番茄果实的番茄红素测定都比非转基因番茄果实中番茄红素高，平均增加了2.8倍。转基因马铃薯块茎中β-胡萝卜素的含量增加了14倍，类胡萝卜素总量增加了2.5倍。Lye-ε环化酶7.4降低有害物质含量利用RNAi沉默技术抑制亚麻苦苷和百脉根苷合成途径中的两个关键酶的表达得到的转基因木薯块茎中含氰苷含量降低92％、叶片中氰苷含量低于野生型氰含量的1％，极大改善了木薯的营养价值。转基因植物中可可碱含量下降了30%-80%，咖啡因含量下降50%-70%，这将使咖啡因对敏感人群的刺激降低，使引发心悸、高血压、失眠等症减少。咖啡植物中编码可可碱合成酶基因的表达棉花分部广泛，是纺织业主要纤维来源。也是亚非二千万农民重要经济作物。获得1公斤纤维的同时，产生1.65公斤含有高质量蛋白的棉籽。然而，棉籽一直未能充分利用，原因在于其体内的毒性分子——棉酚。棉酚贯穿于棉树的茎、叶等各种组织，以抵御昆虫、病毒对棉树的攻击，只有反刍动物能够以棉株为食。因此有人设想在维持棉树高产棉纤维的同时，开发棉树蛋白，满足数百万人的蛋白需求。2006年，Ganesan等通过RNAi技术抑制了棉籽中棉酚合成途经中δ-杜松烯合成基因的表达，获得的转基因植株与野生型棉籽相比棉酚含量降低了99％，而叶片及花中的帖类化合物没有减少，其对病害及昆虫的抗性亦没降低。7.5利用RNAi提高果实耐贮性采用基因工程技术提高果实耐贮性，主要是以SAM水解酶、ACC合成酶、ACC氧化酶、ACC脱氨酶等酶的基因为靶基因使其沉默，从而达到果实耐贮的目的。其中以ACC合成酶和ACC氧化酶基因研究较多。Xiong等构建了含有ACC氧化酶基因的序列的RNA干扰载体用于转化番茄，结果有69%的转化植株表现出100%的干扰效果，18%的植株表现出50%的干扰效果，果实从破色期到成熟期依次需要120d，30d，而对照只有5d。aFruitoftransgenicplanttomatoshowedfull-RNAi.bFruitofnontransgenicplantHezuo906.CChangesinthecolorsoftomatofruitsofcv.Hezuo906plantsfrombreaker+1daytobreaker+120days,semi-RNAiandfull-RNAitransgenicplantsofACCoxidase:afruitofthecontroltomatoplantchangedtoredatbreaker+5days,bsemi-RNAitransgenictomatofruitchangedtoredatbreaker+30days,cfull-RNAitransgenictomatofruitchangedfirsttobuffandthentoaweak-redcolorveryslowly;atbreaker+120days,thefruitwasrosyincolorabc陈银华通过构建了番茄ACO的RNA干涉载体，并获得了大大抑制了内源ACO基因的表达的转基因植株从而导致乙烯的生成大大降低。可用于改良番茄的耐贮性。柿果可见，利用RNAi技术调控果实成熟，具有里要的理论意义、巨大的经济效益和应用前景。利用RNAi技术抑制ACC氧化酶基因砂梨百合花椰菜延长果品的贮藏期或延缓果品衰老，并取得了一定的进展7.6利用RNAi提高抗褐化能力

多酚氧化酶（PPO）是植物、细菌和真菌等生物体内普遍存在的一种酶，是农产食品加工过程中产生酶促褐变的关键酶类。在果实和蔬菜收获后或加工时，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养，抑制PPO活性可以减弱褐变程度。应用RNAi技术抑制PPO活性控制了马铃薯的褐变获得的转基因苹果植株内PPO基因的干扰效果达91.69%以上，从而证实了PPO双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的。希望在不影响小麦的生长、抗逆性的前提下，特异地抑制小麦籽粒中PPO合成，从而减弱面粉及其面食品在加工、贮藏中的褐变，提高面粉白度。7.7

利用RNAi进行代谢调控

以获得目的次生代谢物吗啡可待因酮可待因酮与吗啡共同的前体分子可待因酮还原酶基因家族2004年，Allen等成功应用RNAi技术抑制罂粟中可待因酮还原酶基因家族基因的表达，极大地提高罂粟中吗啡的含量罂粟中的网状番茄枝碱胡新玲等利用RNAi对14β－羟基化酶(14OH)基因表达进行抑制后，可能阻断中间产物流向C-14氧取代的紫杉烷，而走向紫杉醇等C-13氧取代的紫杉烷，从而大幅度地提高后者的产量。Dubouzet等在2005年报道了用RNAi技术抑制黄连中异喹啉生物合成途径中金黄紫堇碱9-O甲基转移酶基因，使该酶的表达水平明显降低。7.8利用RNAi培育抗病虫害作物在天然状态下，棉花为了保护自身免遭昆虫啃食，会分泌一种棉毒素，但这一招却对棉铃虫无效。“狡猾”的棉铃虫在进化中，发展出了一套完善的解毒机制，能肆无忌惮地对棉花侵害，每年造成我国棉花生产数十亿元的经济损失。在帮助