分子生物学实验报告

分子生物学试验报告Revisedasof23November2023分子生物学试验命科学与技术学院专业：生物科学〔基地〕班级： 202301班分子生物学根底试验分子生物学试验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不行DNA的重组；PCR基因扩增等等。试验一质粒DNA的小量制备一、试验原理运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体〔vector〕。载体的设:(1)体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；〕入；〕载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因〕，抗霉素基因细胞中分别筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。具有双链闭合环状构造的DNA分子，主要觉察于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒就不能存活，而它掌握的很多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。1个或几个质粒分子。后者的质粒在质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格掌握。小的质粒，如ColEⅠ质粒〔含有产生大肠杆菌素E1基因〕，拷贝数较多，复制不受严格掌握。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒连续复制12－16h20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的240％－50％。本试验分别提纯化的质粒:培育细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分别和纯化质粒DNA。承受溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠〔SDS〕可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂〔SDS〕处理后，细菌染色体中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本试验中，自DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、试验目的把握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。了解制备原理及各种试剂的作用。三、试验材料和试剂材料：大肠杆菌，含pBR322质粒。试剂：pH至左右。如固体培育基则添加15g/L琼脂。EDTA。灭菌后存放。LTris-HCl抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面掩盖等体积的mol/LTris-HCl，4℃保存。无水乙醇7.70％乙醇.20μg/mL。仪器：四、操作步骤〔一〕培育细菌50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LBAmpLB培育基冷却到50℃左右方可参加。〔二〕从菌落中快速提取制备质粒DNA弃上清，参加150μLGET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。配制的L〔不要振荡次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。15min。离心一次。用()，备用。保存，供下午电泳使用。泳，下面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法：EBDNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将浓度的标准样品表2－1照，只需要5－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。工程中常常被用做检测DNA样品。片段 碱基对数目/kb 相对分子质量含量/(ng/mg)1×1062×1063×1064×10695×1066×1067×10688×106琼脂糖凝胶板的制备1．琼脂糖凝胶的制备称取琼脂糖，置于锥形瓶中，参加100mLTBE缓冲液，于电炉上加热，注使其终浓度为1％。胶板的制备个边脚模子。留意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。65℃左右的琼脂糖凝胶，留神地倒在内槽上，掌握灌胶速度，使胶液缓慢地开放，轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。胶板内的样品小槽加样用移液枪将上述样品分别参加胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避开穿插内，防止碰坏样品槽四周的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本试验加样为MarkerλDNA/HindⅢ)电泳DNA片段的最大区分率，电场强度不应5V/cm。1～2cm处，停顿电泳。染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进展染色以观看在琼脂糖凝胶中的DNA带。20min后，用大量水冲洗。观看DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。五、留意事项收集菌体提质粒前，培育基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；参加溶液Ⅲ后，消灭絮状沉淀。苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严峻烧伤及衣物损坏，使用时应留意。如不留神皮肤上遇到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所LTris-HCl进展平衡。所以取酚Tris-HCl液隔绝空气层。酚/氯仿//氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时留意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。部弃用，不回收。。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。DNADNA后，经琼脂糖凝胶电泳，图谱如下：图中MMarker，4号为本人所提取的质凝胶电泳的检测图，本人所用的质分子条带较为光明，说明所提取的浓度很高；前面原理局部提到，质粒分子的构造多样，包括超螺旋构造，泳动速度不同，所以在图谱中显示有多条不会单独检测质粒DNA，或者检测质粒DNAMarker，这主要是由于质粒分子构造多样，在电泳图谱中并不能够正确显示其大小。七、思考题裂解细菌时需留意的事项有哪些答：首先留意的是SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，假设质粒长时间暴露于NaOH,质粒有可能不行逆变性，使得抽提质粒中有局部是变性质粒。这些变性质粒，SDS-KOH5分钟，最好在冰里处理，Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合肯定要严峻，承受上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上猛烈振荡，否则会是质粒断裂，影响提取的效果与浓度。质粒的根本性质有哪些自主复制和转录力量；可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中。3．碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么答：溶液Ｉ:GET缓冲液，葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管EP的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。是Ca2＋和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中参加EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。溶液Ⅱ：LNaOH(内含1%的SDS)，NaOH是最正确溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是bilayer〔双层膜〕构造向micelle〔微囊〕SDS是离子型外表活性剂。它主要作用质结合成为R-O-SO3

进展。溶液Ⅲ：乙酸钾溶液，的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III参加后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-聚合，后者是由于盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。降解作用，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子外表又含有很多极性基团与苯酚相像相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相，使用酚能有效变性蛋白质，抑制的降解作用；氯仿能抑制酚的缺点，加速有机相与液相分层，去除核酸溶〔酚易溶于氯仿中〕；异戊醇的作用是削减蛋白质变性操作过程中产生使离心后的上层含质粒DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，DNA四周的水分子，DNA失水聚合。70%乙醇：将质粒DNA外表的离子洗去。pHTE缓冲液：由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有肯定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸取样品中含有DNA的水分，削减DNA的损失。用Tris调整至pH8是由于DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下RNA比DNA更简洁游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。DNA的方法包括哪几个步骤裂解细胞，使蛋白质与DNA变性，利用醋酸盐沉淀基因组DNA、细胞碎片与蛋白醇与水互溶，而DNA在醇中不行溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。DNA的产量DNA16小时的菌液状态最好，最适合提取，可以在此根底上扩大接种量，等比例扩大LB培育基的体积，实行屡次抽提的方法提高质粒DNA的产量；其次是在提取过程中留神慎重，在参加苯酚/氯仿溶液离心之后留神吸取的同时尽量吸取完全，削减损失。留意些什么TE缓冲液中含有水分，会结成冰晶DNA分子的间隙中，而在4℃条件下不会消灭这种状况。假设是质粒DNA分子断裂，导致得到线性4℃冰箱保存，便利使用，而对于临时-20℃冰箱，长期保存。试验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定一、 试验原理测定核酸通常承受两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。紫外分光光度法DNA或RNA定量时，应在260nm280nm两个波长下读数。依据计算在260nm波1ug/mLDNA钠盐的A值为，即在A=1时，双链DNA50ug/mL，单链260DNA与RNA40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为33ug/mL。双链DNA含量＝A×50×稀释倍数〔ug/mL〕260×260单链DNA含量＝A×33×稀释倍数〔ug/mL〕260此外还可以依据260nm280nm的读数间的比值〔A

/A〕估量核酸的纯度。琼脂糖凝胶电泳法

260

280DNA分子量不同，承受外加电场使其分开，用EBDNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将浓度的标准样品表2－1作为电泳比照，就可以估量出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍工程中常常被用做检测DNA样品。片段片段相对分子质量含量/(ng/mg)1 2×1063×1064×10695×1066×1067×1068×106100%二、试验目的1．从以上试验中提取到的质粒DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化试验，必需测定DNA的纯度、含量以及分子量大小。大小。三、试验材料和试剂材料：自制的质粒DNA、λDNA/HindⅢ、。试剂：EcoRⅠHindⅢ10X缓冲液马上用大量的水冲洗干净。5×TBE母液，6．％琼脂糖四、试验操作〔一〕质粒DNA的酶解1．提的质粒，在10uL的体系中用单一酶〔如EcoRⅠ〕进展处理，即：质粒DNA 5μL10×缓冲液 1μL

coRⅠ LμddHO 4Lμ2备用。〔二〕琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶的制备称取琼脂糖，置于锥形瓶中，参加100mLTBE缓冲液，于电炉上加热，注使其终浓度为1％。胶板的制备个边脚模子。留意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。65℃左右的琼脂糖凝胶，留神地倒在内槽上，掌握灌胶速度，使胶液缓慢地开放，轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。胶板内的样品小槽加样用移液枪将上述样品分别参加胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避开穿插内，防止碰坏样品槽四周的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本试验加样为MarkerλDNA/HindⅢ)电泳DNA片段的最大区分率，电场强度不应5V/cm。1～2cm处，停顿电泳。染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进展染色以观看在琼脂糖凝胶中的DNA带。20min后，用大量水冲洗。观看DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。五、留意事项吸样量的正确性，确认样品确实被参加反响体系。放回－20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于0℃以上的环境中，以防止酶失活。3．酶切加样次序为水、缓冲液和DNA，然后混匀。酶永久是最终参加的，如将酶直步操作是整个试验成败的关键，留意防止错加、漏加。4．为了避开穿插污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。5．溴化乙锭是一种猛烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进展操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。六、试验结果与分析如下图，M为Marker1为被酶EcoRI所切后的质粒跑出来的条带。由于质1只有一条条带。查资料知道pEGFP-N3质粒的大小为4729bp，大小根本符合。2号泳DNA通过琼脂糖凝胶时速度不一。由不明显，说明提取的质粒浓度较小。这三种DNA的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但也受所用电流强度、缓冲液的离子强度及超螺旋度的影响。七、思考题EB显色的原理。胶中的核酸。是一种核酸染料，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色，是一种强的诱法使用于一般性的核酸检测。EB分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增加20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的中参加终浓度为μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观看核酸的迁移状况，这种方法使用于一般性的核酸检测。使用溴化乙锭时应留意什么答：不慎与眼睛接触后，马上用大量清水冲洗并征求医生意见；穿戴适当的防护服、说明不同电压对电泳结果的影响是什么答：限制性内切酶消化后的DNA分子片段，低电压时，迁移率与所用电压成正比。在电场强度增加时，不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越范围将缩小。原则上场强度不要超过5V~8V/cm，高电压可明显产热，严峻时会引起凝胶熔化或DNA50V左右的低电压可以让DNA分子片段沉降到胶和小片段样本〔简洁在凝胶中集中消逝，显色不清〕尤其有利于观看到清楚结果。为了提高效率，节约时间，在核酸条带浓缩集中后〔10~20min〕，可以转换高电压100V~时，停顿电泳。综上，两种电压交替使用既提高分别效果，又较好节余时间。DNA的纯度答：DNA纯度的推断依据OD260/OD280的比值推断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在之间，低于此范围说明蛋白质含量超标，高于此范围说明样品中含有RNA。试验三感受态细胞的制备及转化一、试验原理DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得的遗传性形，转化混合物中的DNADNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞外表，DNA复合物，在选择性培育基平板上培育，可选出所需的转化子。二、试验目的学习和理解影响细胞感受态的因素，把握感受态细胞的制备方法。把握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有遗传性，并从中选择出转化子。三、试验材料和用具)。试剂：琼脂平板仪器：蒸汽灭菌锅。四、操作步骤(一)大肠杆菌感受态细胞的制备从活化的α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培育基中，37℃振荡培1：5050mLLB液体培育基中，37℃快速振荡培育3～4h。离心10min。溶液轻轻悬浮细胞，冰15～30min。弃上清，参加200μLLCaCl2溶液，留神悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。制好的感受态细胞可在冰上放置。(二)细胞转化摇匀后的感受态细胞悬液，进展下一步的转化，转化如下〔单位：编号质粒感受态细胞无菌水LCaCl2样品2100//1/1002/22//100μL〕：将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min42℃水浴中保温90s，然后快速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别参加400μLLB液体培育基，使总体积胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。(三)平板培育取各样品培育液100μL分别接种于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB平板培育重叠时停顿培育。质粒比照组转化试验组五、留意事项

无菌落长出有大量菌落长出

结果分析不含杂菌质粒进入受体菌中产生抗药性这一个试验中的全部操作均要为无菌操作，在超净工作台内进展。制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的肯定不要在室温中放置。六、试验结果与分析经过一夜培育后，其次天上午9点从烘箱中取出培育皿观看结果如以下图所示，试验落长出；比照组1即受体菌比照组不含卡那的平板有大量菌落长出，含卡那的平板没