酶工程酶的发酵生产

第二章酶的发酵生产第一页，共五十页。酶的发酵生产第一节酶生物合成的基本理论第二节酶发酵生产常用的微生物第三节发酵工艺条件及控制第四节酶发酵动力学第五节动植物细胞培养生产酶第二页，共五十页。第一节酶生物合成的基本理论一、RNA的生物合成——转录二、蛋白质的生物合成——翻译三、酶生物合成的调节第三页，共五十页。一、RNA的生物合成—转录转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA的过程。转录速度表达式?第四页，共五十页。二、蛋白质的生物合成—翻译翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的作用，合成多肽的过程。四个阶段1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA2、肽链合成的起始3、肽链的延伸4、肽链合成的终止思考:密码子偏爱性与翻译速率?第五页，共五十页。第二节酶发酵生产常用的微生物

（酶的生产菌种）一、产酶菌种的要求二、常用的产酶微生物三、利用微生物产酶的优点四、高纯菌种的获取第六页，共五十页。一、产酶菌种的要求1、发酵周期短，产量高；2、容易培养和管理；3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染；4、有利于酶的分离和纯化；5、安全性可靠，非致病菌。第七页，共五十页。二、常用的产酶微生物1、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)2、大肠杆菌(Escherichiacoli)3、黑曲霉(Aspergillusniger)4、米曲霉(Aspergillusoryzae)5、青霉(Penicillium)6、木霉(Trichoderma)7、根霉(Rhizopus)8、毛霉(Mucor)9、链霉菌(Streptomyces)10、啤酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)11、假丝酵母(Candida)第八页，共五十页。微生物发酵法微生物酶①微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全，几乎所有的酶都能从微生物中得到②微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量③微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的产酶高的菌株优点商品酶的主要生产方法第九页，共五十页。微生物发酵法高产优良菌株培养和繁殖代谢和积累分离和纯化酶制剂酶的发酵技术第十页，共五十页。微生物发酵法产酶微生物菌种保藏机构自然界研究或生产机构温泉森林深海火山土壤产酶微生物的来源第十一页，共五十页。国外菌种保藏机构ATCC(AmericanTypeCultureCollection） 美国典型菌种保藏中心NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection) 美国农业研究菌种保藏中心DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH) 德国微生物菌种保藏中心NBRC(NITEBiologicalResourceCenter) 日本技术评价研究所生物资源中心第十二页，共五十页。ATCCATCC(AmericanTypeCultureCollection）美国典型菌种保藏中心

ATCC主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。

该中心保藏有藻类111株，细菌和放线菌16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。

第十三页，共五十页。NRRLAgriculturalResearchService(ARS)CultureCollection

原为NorthernRegionalResearchLaboratory

NRRL是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。

该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放线菌9500株。

第十四页，共五十页。DSMZDSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)德国微生物菌种保藏中心

DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。

该中心是欧洲规模最大的生物资源中心，保藏有细菌9400株，真菌2400株，酵母500株，质粒300株，动物细胞500株，植物细胞500株，植物病毒600株，细菌病毒90株等。第十五页，共五十页。NBRCNBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技术评价研究所生物资源中心

NBRC是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。原为IFO(

InstituteforFermentation,Osaka,大阪发酵研究所)。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。

该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。

第十六页，共五十页。国内菌种保藏机构ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心AS 中国科学院微生物研究所CICC 工业微生物菌种保藏管理中心IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所第十七页，共五十页。微生物发酵法微生物的筛选粗筛菌种分离含菌样品采集产酶性能微生物优良微生物诱变基因工程其它方法第十八页，共五十页。微生物发酵法酶的生产过程培养基发酵方法发酵控制通气供氧分离纯化精制第十九页，共五十页。微生物发酵法酶的发酵生产方式固体发酵液体深层发酵第二十页，共五十页。固体发酵表面培养或曲式培养以麸皮、米糠等为基本原料，加入适量的无机盐和水作为培养基进行产酶微生物菌种培养的一种培养技术浅盘培养转鼓培养多用通风式厚层培养固体发酵技术原理微生物发酵法第二十一页，共五十页。微生物发酵法固体发酵法设备简单，便于推广，特别适合于霉菌的培养和产酶发酵条件不易控制、物料利用不完全、劳动强度大、容易染菌等优点缺点不适于胞内酶的生产第二十二页，共五十页。液体深层发酵浸没式发酵利用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气培养方式液体发酵技术原理酶制剂生产的主要培养方式原料的利用率和酶的产量都较高，培养条件容易控制微生物发酵法第二十三页，共五十页。常用的酶制剂-1第二十四页，共五十页。常用的酶制剂-2第二十五页，共五十页。酶的生物合成酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制基因决定形成酶分子的化学结构代谢物（酶反应的底物、产物或类似物）控制和调节酶的合成诱变或基因工程来培育优良品种工艺调控第二十六页，共五十页。生产工艺-工艺流程-胞外第二十七页，共五十页。生产工艺-工艺流程-胞内第二十八页，共五十页。生产工艺——培养基生长因子

——酶生产时需要供给微生物生长所需的氨基酸、维生素、嘌呤碱和嘧啶碱等生长因子。一般通过加入玉米浆、酵母膏、麸皮、米糠，以及豆饼等来提供。例如：添加含有生长因子的大豆酒精提取物，可使米曲酶的蛋白酶产量提高1.9倍。产酶促进剂

——少量加入之后能显著增加酶产量的物质。一般都是酶的诱导物或表面活性剂。例如纤维素能诱导纤维素酶，吐温80可提高多种酶的产量。表面活性剂提高酶产量的作用机制目前还未完全了解，使用时必须考虑其对微生物是否有毒性。生产上提高胞外酶的活力，一般都采用非离子表面活性剂。碳源、氮源、无机盐第二十九页，共五十页。生产工艺——工艺控制pH值的影响及控制

——

酶生产的合适pH通常和酶反应的最适pH值相接近。生成碱性蛋白酶的芽孢杆菌宜在碱性环境下培养；生产酸性蛋白酶的青霉和根霉应在酸性环境下培养。温度控制

——

为了有利于菌体生长和酶的合成，可进行变温生产。例如枯草杆菌AS1.398进行中性蛋白酶生产时，培养温度从31oC逐渐升温至40oC，然后再降温至31oC进行培养，产量提高66%。

重组E.coli一般先37ْC培养，加诱导剂后28ْC产酶。第三十页，共五十页。生产工艺——工艺控制生长期与产酶的关系

——

微生物生长期与产酶有一定的关系，因菌种而异常。如曲霉的蛋白酶当菌体生长进入对数生长期时大量分泌；芽孢杆菌的碱性蛋白酶在对数生长期末大量形成芽孢时才生成。通气搅拌的影响

——

酶生产所用的菌种一般都是需氧微生物，培养时都需要通气搅拌。一般，通气量少对霉菌的孢子萌发和菌丝生长有利，对酶生产不利。因此必须根据不同的需要控制不同时期的通气量。第三十一页，共五十页。

生产工艺——提取发酵液预处理酶的沉淀或吸附（盐析法、有机溶剂沉淀法或白土或活性氧化铝吸附）干燥（收集沉淀进行干燥磨粉，加入适当的稳定剂、填充剂等制成酶制剂；或在酶液中直接加入适当的稳定剂、填充剂，直接进行喷雾干燥）酶的提取：第三十二页，共五十页。

酶制剂产品液体酶固体酶第三十三页，共五十页。生产工艺—造粒酶粒是在大型连续运转的水平混合机内生产出来的。提取的酶与盐、纤维素及其他成分混合形成0.5mm大小的粒状物。然后用一种聚合体包裹，以防止酶尘在使用过程中可能引起的致敏危险。造粒对顾客及包含酶的最终产品来说，都是一种非常有效和安全的运输固态酶的方式。用多聚体包裹酶以减少酶尘引起的致敏危险。第三十四页，共五十页。生产工艺—生产废渣处理生产废渣实际上是有益于环境的。可被用做当地农田的肥料。确保所有的微生物均经灭活之后才能从生产车间中运出。将含硅藻土、培养基和微生物的发酵液经加热及用碳酸钙进行处理。处理后的发酵液废渣最终为可持续性工业解决方案做出了贡献。即使是生产废渣也是有用的；它们可以用作肥料。将生产废渣用做肥料第三十五页，共五十页。

生产工艺-中性蛋白酶工艺流程第三十六页，共五十页。提高酶产量的方法酶合成的调节机制：在正常情况下，酶产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的调节机制是操纵子理论。第三十七页，共五十页。打破酶合成调节限制的方法：1、通过条件控制提高酶产量：添加诱导物降低阻遏物浓度2、通过基因突变提高酶产量：使诱导型变为组成型，使阻遏型变为去阻遏型3、其它提高酶产量的方法：添加表面活性剂添加产酶促进剂第三十八页，共五十页。第四节酶发酵动力学发酵动力学：主要研究在发酵过程中细胞生长速率，产物形成速率以及环境因素对速率的影响；在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提高酶产量具有重要的理论指导意义。酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生长的关系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。第三十九页，共五十页。同步合成型：又称生长偶联型,是指酶合成与细胞生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大量合成；当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止。延续合成型：酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间。中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。滞后合成型：只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累。第四十页，共五十页。浓度时间(h)细胞浓度酶浓度细胞浓度酶浓度酶浓度酶浓度细胞浓度细胞浓度A.同步合成型;B.延续合成型;C.中期合成型;D.滞后合成型ABCD酶生物合成模式第四十一页，共五十页。影响酶生物合成模式的因素主要是mRNA和培养基中存在的阻遏物：mRNA稳定性高的，可以在细胞停止生长后继续合成相应的酶；mRNA稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成；不受阻遏物阻遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；受阻遏物阻遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻遏,才能开始酶的合成。第四十二页，共五十页。在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期,最理想的酶合成模式是延续合成型；对于其它类型的酶,要在菌种选育和工艺条件上加以调节；对于同步合成型，尽量提高mRNA的稳定性，如降低发酵温度;对于滞后合成型,尽量减少阻遏物；对于中期合成型，要从提高mRNA稳定性和解除阻遏两方面进行。第四十三页，共五十页。第五节动植物细胞培养生产酶

利用动植物细胞培养生产各种天然物质，是生物工程的一个新领域，20世纪80年代以来，利用植物细胞培养生产的有用产物已达100多种，其中酶制剂有10多种。包括糖苷酶(胡萝卜细胞，1981)，过氧化物酶(甜菜细胞，1983；大豆细胞，1989)等。呈现出良好的发展前景.第四十四页，共五十页。一、动植物细胞的特点:1、体积比微生物大；2、对剪切力敏感；3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵周期长；4、动物细胞营养要求复杂；5、发酵产物不同第四十五页，共五十页。二、植物细胞培养和发酵1、植物细胞发酵技术和特点：发酵特点（与直接提取分离相比较而言）：（1）提高产率；（2）缩短周期;（3）易于管理、减轻劳动强度；（4）提高质量。第四十六页，共五十页。2、植物细胞发酵技术(I)高产细胞系的选择：主要有以下几个途径：材料选择，克隆选择