人羊膜上皮细胞来源、生物学特性及应用前景,人体解剖学论文

人羊膜上皮细胞来源、生物学特性及应用前景,人体解剖学论文羊膜作为一种生物材料用于外科已有100多年的历史，1910年初次报道了羊膜成功应用于皮肤移植[1].近年研究发现，人羊膜上皮细胞〔humanamnioticepithelialcells,hAECs〕具有部分干细胞特性，表示出干细胞的标记物，可分化为三个胚层不同类型的细胞[2].由于hAECs取材方便、易于分离，成为细胞治疗和再生医学的有利工具。2018年国际胎盘干细胞协会〔InternationalPlacentaStemCellSociety,IPLASS〕成立，致力于推动胎盘来源干细胞的基础研究和临床应用，也标志着胎盘来源干细胞已得到越来越多研究者的关注。本文就hAECs的来源、生物学特性等方面，对其临床应用前景进行总结阐述。1hAECs的来源羊膜〔amnioticmembrane,AM〕属于胎儿附属物，是胎膜和胎盘的部分组织。羊膜组成胎膜和胎盘的最内层，并覆盖脐带外表，与胎儿皮肤相连。羊膜为半透明薄膜，结实、坚韧而柔软，光滑，无血管、神经及淋巴。正常羊膜厚0.02~0.05mm,由羊膜上皮〔amnioticepithelium,AE〕和结缔组织构成[2].羊膜上皮由单层的羊膜上皮细胞构成。羊膜是高变异性的组织，位于胎盘外表的羊膜上皮层为柱状上皮细胞，周围部分的羊膜上皮层是扁平上皮细胞。羊膜与羊水直接接触，电镜下可见羊膜上皮细胞外表有微绒毛，使羊水与羊膜间进行物质交换。通常可将羊膜与绒毛膜机械分离，并通过胰酶等进行一1growthfactor,EGF〕存在的培养基中，hAECs通常可生长2~6代。低密度的状态下生长较缓慢。体外培养的hAECs呈中等大小的圆形细胞，核居中或偏于一侧，可有一个或两个细胞核，胞质丰富。hAECs的增殖呈典型的鹅卵石样上皮细胞形态。hAECs在自分泌的转化生长因子〔transforminggrowthfactor-，TGF-〕的作用下，可自发经历上皮-间充质转化〔ep-ithelial-mesenchymaltransition,EMT〕[3].2hAECs的生物学特性2.1hAECs表示出干细胞标记物hAECs在体外培养条件下，可表示出间充质干细胞标记物；除此之外，hAECs还可表示出胚胎干细胞标记物、多能干细胞标记物等[4-5].间充质干细胞标记物：CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、HLA-A,B,C、CD13、CD10、CD166、CD49e、CD117〔表示出量极低〕,并且不表示出CD14、CD34、CD45、HLA-DR.胚胎干细胞标记物：阶段特异性胚胎抗原SSEA-3、SSEA-4,肿瘤排挤抗原TRA1-60、TRA1-81.多能干细胞标记物：octamer-4〔OCT-4〕、NANOG、sexdeterminingregionY-box2〔SOX-2〕、Lefty-A、FGF-4、REX-1,andteratocarcinoma-derivedgrowthfactor1〔TDGF-1〕〔cripto-1〕。其他：CD324〔E-cadherin〕、CFC1、DPPA3、PROM1、PAX6、CD140b、GCTM2、ATP结合盒转运蛋白G2〔ABCG2/BCRP〕、CD9、CD24、整合蛋白6、1、c-met〔肝细胞生长因子受体〕。原代hAECs中，SSEA3、SSEA4和TRA阳性的细胞分别为15%、50%和5%~10%[4].显着大于成体干细胞的比率〔0.1%~0.01%〕。Miki等[6]以为，原肠胚构成是器官发生的开场，由于hAECs发生于原肠胚构成前，加之羊膜腔的阻隔，原肠胚的短程器官构成信号分子可能不能完全作用于成羊膜细胞，因而保存有较多的干细胞特性。2.2hAECs的免疫特性羊膜应用于多种外科治疗已有100多年，包括皮肤烧伤、皮肤创伤后修复、腿部溃疡等不同部位的创伤[7],泌尿生殖道及颌面部等部位重建手术，以及多种溃疡外表的重建[8],均未出现免疫抑制或急性排挤反响。羊膜细胞的免疫特性表如今其特殊的免疫分子表示出谱。hAECs低表示出MHCⅠ类分子〔HLA-A,B,C,G〕,不表示出MHCⅡ类分子〔HLA-DR〕，还表示出HLA-G、CD80〔B7-1〕、CD86〔B7-2〕、CD40和CD40L[9].hAECs持续性表示出非典型MHCⅠ类分子HLA-G.通常持续性表示出HLA-G的组织为免疫豁免组织，如睾丸、卵巢、胎儿细胞。HLA-G有重要的免疫调节功能。主要由ILTR辨别，表示出于T、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞外表，结合后消除活性信号。hAECs是一类免疫豁免细胞，能在免疫不相容的异体移植受者体内存活。在无免疫抑制剂的作用下，异体移植的羊膜或hAECs仍不发生急性免疫排挤反响。体外实验中，从羊膜中分离的细胞不表现出同种和异种的免疫反响，并且能较强地抑制淋巴细胞增殖。体内实验证实，人羊膜和hAECs可移植到同种和异种的具有免疫功能的动物体内，未表现出免疫排挤。人羊膜和hAECs能在有免疫力的动物，如兔、鼠、豚鼠、帽猴体内长期存活，提示这类细胞不具有免疫原性。除此之外，在无免疫抑制治疗的情况下，将人羊膜和hAECs应用于外科治疗，也均未见急性排挤反响。3hAECs的临床应用前景hAECs可表示出干细胞标记物，提示其可能具有干细胞特性。与人胚胎干细胞一样，hAECs不具有构成单个细胞克隆的能力，并且由于其基因稳定性，在移植入异种动物体内也不构成畸胎瘤[4].因而，只能通过构建嵌合体小鼠验证其干细胞特性。在体外条件下，利用小鼠的胚胎干细胞和人羊膜细胞诱导成嵌合体小鼠。在嵌合体小鼠胚胎中，三个胚层中均有人细胞的分布[10].尽管该细胞系为人hAECs和羊膜间充质细胞的混合，仍成功揭示了羊膜细胞的多能性。进一步的研究证实，hAECs在体外诱导条件下可分化为三个胚层的细胞，包括外胚层的神经元和神经胶质细胞[11],中胚层的心肌细胞肌细胞、骨细胞、脂肪细胞[12],内胚层的肝脏[13]和胰腺细胞[14]等。3.1hAECs在神经系统疾病治疗中的应用前景hAECs在治疗中枢神经系统疾病方面有着宏大的潜力。1996年Sakuragawa等[15]发现，体外培养的hAECs表示出神经元和神经胶质细胞特异性蛋白，自此hAECs就开场被用于细胞治疗的研究。随后有研究证实，hAECs还可合成分泌乙酰胆碱、儿茶酚胺、多巴胺。进一步实验也证实，hAECs可表示出神经标记基因，如神经特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、髓鞘碱性蛋白、微管相关蛋白-2、胶质原纤维酸性蛋白等[4].利用腺病毒标记系统证实，约20%的hAECs表示出少突胶质细胞标志基因，如髓鞘碱性蛋白、蛋白质脂蛋白〔PLP〕和2,3-环腺苷酸-3-磷酸二酯酶〔CNPase〕。帕金森病〔Parkinsonsdisease,PD〕是由脑黑质的多巴胺〔dopamine,DA〕神经元的进行性死亡导致。将hAECs移植入免疫抑制的PD大鼠模型，可改善其DA神经元退化作用，并且其功能明显恢复[16].这可能通过分泌DA和其他可溶性分子发挥作用。在非免疫抑制的大鼠中的进一步实验证实，hAECs移植的大鼠脑黑质中DA和DOPAC〔3,4-二羟基苯乙酸〕分泌明显增加，脑脊液中DA含量明显增加[17].除此之外，hAECs对于脑卒中、脊髓损伤等神经系统疾病有着潜在的治疗前景。hAECs移植入大脑中动脉闭锁的模型中，可迁移到缺血区域，减少梗死面积，提高行为功能[18].hAECs移植入脊柱横断的猴子中，可促进轴突迅速增长，并且抑制了脊柱微神经元的死亡[19].通过行为评估，移植后的hAECs能在损伤的急性期起到神经保卫的作用，并且在长期恢复经过中促进长纤维束的再生，而改善脊髓损伤动物的功能。大量体内体外实验证明，hAECs可能通过分化为神经细胞，或分泌神经营养因子而起到改善疾病的作用。3.2hAECs在心脏疾病治疗中的应用前景由于成熟心肌细胞的不可再生性，利用干细胞移植重建病损心脏丧失的心肌细胞、改善缺血心肌的功能，被视为有临床应用前景的、治疗冠心病尤其是急性心肌梗死的新途径。Miki等最早对hAECs可分化为心肌细胞做出了研究，在hAECs培养基中添加抗坏血酸培养14天后，通过RT-PCR可检测到心房型肌球蛋白轻链〔MLC-2A〕、心室型肌球蛋白轻链〔MLC-2V〕、GA-TA-4及心肌细胞特异性转录因子Nkx2.5的表示出[4].体内实验证实，将人羊膜块移植入大鼠心肌缺血模型，明显改善了缺血后心脏功能；实验组动物表现为心脏收缩功能提高、左室短轴缩短率提高和室壁增厚；但在大鼠心肌组织中未检测到人细胞。提示这些功能的改善应是羊膜细胞分泌的调节因子的作用，起到了保卫和促进宿主组织再生[20].然而，不同于组织块的移植，hAECs注射入心肌梗死的大鼠模型的心肌梗死区域4周后，存活的hAECs中3%可表示出心肌特异性蛋白肌球蛋白重链。实验组动物的心脏射血分数升高，PET及组织学显示梗死区域减少，梗死区域心肌基因和蛋白表示出增高。证实了hAECs在体内条件下可分化为心肌样细胞，减少梗死区域，改善心肌功能[21].因而，羊膜和hAECs改善心肌缺血华而不实的机制有两种可能：一是移植细胞分化为心肌细胞或者血管内皮细胞和平滑肌细胞；二是移植细胞刺激了血管生成和预防了心肌细胞的死亡。3.3hAECs在肝脏疾病治疗中的应用前景近年肝脏移植成为治疗晚期肝脏疾病的新方式方法，但却遭到肝脏来源短缺的限制。hAECs具有分化为肝脏细胞的能力，成为潜在的移植来源。Sakuragawa等[22]报道，体外培养的hAECs可分泌白蛋白〔Alb〕和甲胎蛋白〔AFP〕。进一步研究发现，未分化的hAECs表示出白蛋白、-抗胰蛋白酶、1-AT、CK-18、CPS-1、PEPCK等肝细胞基因，而诱导后的hAECs表示出1-AT、CK-18、CPS-1、CYP3A4、PEPCK等肝脏相关基因量增加，并且可合成分泌白蛋白、贮积糖原[23].通过外源性生长因子刺激方案诱导hAECs分化为肝脏细胞，能分泌多种成熟肝脏特异性标志蛋白，华而不实包括重要的药物代谢相关的细胞色素P450基因。羊膜块移植入SCID小鼠腹腔后可存活并在小鼠的血清和腹水中可检测到人白蛋白的分泌[23].hAECs移植入SCID小鼠的肝脏后，表现为Alb和AFP阳性，并且融合为肝脏本质组织[22].hAECs移植入免疫缺陷小鼠后，在小鼠血清中检测到人1-抗胰蛋白酶，可进一步证实移植入的hAECs可发挥肝脏细胞的功能。近期研究发现，小鼠肝脏细胞、基质胶或猪肝脏细胞来源的胞外基质，可增加hAECs分化为肝脏细胞的能力。华而不实猪肝脏细胞来源的胞外基质培养的hAECs,其白蛋白和多种CYP基因表示出增加最明显。三明治培养等3D培养法可明显增加这类细胞的功能和活性。倒千里光碱处理的肝脏60%切除小鼠，经脾移植入hAECs6个月后，可在肝脏组织中检测到人源细胞[24].在诱导分化为肝脏细胞的hAECs中，当前可检测到至少30个在成熟肝脏细胞表示出的基因，提示hAECs可成为潜在的移植来源。hAECs也为A1AT缺陷的肝脏和肺疾病等提供了新的治疗思路。4结论人羊膜上皮细胞由于特殊胚胎发育来源，仍保持着部分干细胞特性。大量体内、体外实验都已证实了其潜在的治疗效果。但hAECs不具有长期自我更新和构成单个细胞克隆的能力，其究竟是一种可分化为三个胚层的多能干细胞还是多种各系祖细胞的混合物，仍需进一步的研究。但在临床应用方面，hAECs具有独特的优势：首先，hAECs可分化为三个胚层不同类型的细胞，多种疾病模型实验也证实其潜在的治疗效果。其次，由于hAECs基因的稳定性，移植入免疫缺陷