第二章紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法刘晓燕主要内容：

&重点难点：q紫外可见分光光度分析的基本原理紫外可见分光光度分析的条件选择紫外可见分光光度计的基本构造和使用流程qqqq重点朗伯－比耳定律、分光光度分析的条件选择。难点

朗伯－比耳定律。第一章分光光度分析

(Vis-UVSpectrophotometry)第二章紫外可见分光光度法

1.概念：分光光度法是根据物质的吸收光谱和光的吸收定律，对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。

2.方法分类：根据测定时所选用的光源：

可见分光光度法(400800nm)

紫外分光光度法(200400nm)

红外分光光度法(800nm50m)

优点：⑴灵敏度高,主要用于微量分析；⑵准确度高,浓度测量相对误差仅有1~3%；⑶操作简便、迅速，所需设备并不复杂；

⑷应用广泛。缺点：

⑴仅适合微量分析；⑵所需仪器相对昂贵。3.紫外分光光度法的优缺点11.定性分析各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线2纯度的鉴定用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其杂质有较强吸收，就可方便的检出该化合物中的痕量杂质。3结构分析紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。应用5第一节紫外可见分光光度计的构造分光光度计工作原理：采用一个可以产生多个波长的装置，通过系列分光装置，得到一束平行的波长范围很窄的单色光，透过一定厚度的试样溶液后，部分光被吸收，剩余的光照射到光电元件上，产生光电流，在仪器上可读取相应的吸光度或透光率，完成测定。一．紫外可见分光光度计的基本组成光源单色器吸收池检测器读出系统1．光源在所需光谱区域内发射连续的、足够强度、稳定的辐射光。可见区：钨灯；紫外区：氢灯、氘灯通常用6～12V钨丝灯作可见光区的光源，最适宜的使用范围在360—800nm。光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度氙灯氢灯钨灯色散原理：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同分光入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ28006005004002．单色器单色器是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。单色器由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成。其中色散元件是关键部件。

棱镜是根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。它由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.光栅是根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。入射狭缝：光源的光由此进入单色器，用于限制杂散光进入单色器准直镜：透镜或凹面反射镜，使入射光成为平行光束色散元件：棱镜或光栅，将复合光分解成单色光准直镜：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝出射狭缝：用于限制通带宽度3．吸收池吸收池也称比色皿，用于盛放参比溶液或待测溶液。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm。在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。使用时注意点4．检测器检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。阴极是金属做成的半圆筒，内侧涂有光敏物质，阳极为一金属丝。光电管依其对光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为625—1000nm；紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200—625nm。

光电倍增管是由光电管改进而成的，管中有若干个称为倍增极的附加电极。因此，可使光激发的电流得以放大，一个光子约产生106～107个电子。它的灵敏度比光电管高200多倍。适用波长范围为160～700nm。光电倍增管在现代的分光光度计中被广泛采用。

5．显示装置显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透光率T的方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。二、紫外可见分光光度计类型1.单光束分光光度计2.双光束分光光度计3.双波长分光光度计721分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示单波长单光束分光光度计简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性，且操作麻烦，任一波长的光均要用参比调T=100﹪后，再测样品仪器可见分光光度计双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分器自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。裂仪器紫外-可见分光光度计双波长分光光度计光源单色器单色器切光源检测器吸收池不需要参比溶液；可以消除背景吸收干扰；适合多组分混合物、浑浊试样的定量分析，可进行导数光谱分析。价格昂贵三、仪器使用基本流程紫外可见分光光度计1、分光光度计的保养与维护2、操作的注意事项3、定性分析依据？？？定量依据？？？定性分析基础定量分析基础物质对光的选择性吸收在一定实验条件下,A∝cAc增大AB

A第二节紫外可见分光光度法的定性分析1．分子吸收光谱的产生当一束光照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、原子或离子等粒子与吸光子作用，光子的能量发生转移，使这些粒子由低能量轨道跃迁到高能量轨道，即由基态转变为激发态。M(基态)+hM*(激发态)M(基态)+hM*(激发态)这个过程即是物质对光的吸收。由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不连续的，只有光子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时，才能被吸收。不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的能量也不同，即吸收的波长不同。2、光的种类具有单一波长的光叫单色光，比如红光，蓝光等。由不同波长的光组成的光叫复色光。比如日光等如果两种适当颜色的单色光按适当的强度比例混合能得到白光，则这两种颜色的光叫做互补色光。

互补色光

紫红橙黄绿青蓝青蓝白光溶液的颜色

⑴溶液为什么会有颜色？溶液之所以呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。

⑵吸收光与溶液颜色的关系：当白光通过某一均匀溶液时：CuSO4溶液：之所以呈蓝色，是因为吸收了白光中的黄光，透过其黄光的互补光蓝光。①如溶液对其全不吸收，光全透过，溶液为无色；②如溶液对其全部吸收，无光透过，溶液呈黑色；③如溶液对其部分吸收，其余光透过，溶液呈透过光的颜色。

又例如：

KMnO4溶液，吸收了白光中的绿光，透过的为其互补光紫色，故其溶液呈紫色。

再例如：NaCl、KNO3溶液，对其射入的可见光全不吸收，光全透过，因此溶液为无色。2、吸收光谱曲线

某一溶液对何种波长的光吸收？吸收的程度如何？

这可通过使不同波长的光通过某一固定浓度的有色溶液，分别测量每一波长下对应的光的吸收程度[吸光度

A]，作A-λ曲线，即吸收光谱曲线。溶液的光吸收曲线最大吸收波长maxKMnO4溶液的max=525nmmax/nm吸收强度吸收强度特点:①具有最大吸收波长。②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。但是不同物质，其吸收曲线形状和max不一样，所以可作为定性分析的依据。③不同浓度的同一种物质，在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，测定的灵敏度最高，所以通常选取在max处测量。3、常用术语1）生色团：含有π键的不饱和基团，简单的生色团由双键或三键组成（如乙烯基、乙炔基等）2）助色团：本身没有生色功能（不能吸收波长大于200nm的光），但当与生色团连接时，有增强生色团生色能力的基团（如—OH，—NH2，—NHR等）3）蓝移（或紫移）：指吸收峰向短波长方向移动，红移：指吸收峰向长波长方向移动。吸收峰强度变化包括增色效应和减色效应。前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。各种因素对吸收谱带的影响结果下图

4、常见有机化合物的紫外可见吸收光谱（1）270-750nm无吸收峰。饱和化合物，单烯。（2）

270-350nm有吸收峰（ε=10-100L/（mol*cm）），n→π*跃迁，含有一个简单的非共轭且含有n电子的生色团（3）

250-300nm有中等强度的吸收峰,（ε=200-2000L/（mol*cm

），如苯环。（4）

210-250nm有强吸收峰，表明可能含有2个共轭双键；在260nm,300nm,330nm有强吸收峰，说明是3个或3个以上双键的共轭体系。

（5)若吸收峰延伸至可见光区，则可能是长链共轭或稠环化合物一、朗伯-比尔定律

朗伯-比尔定律是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和液层厚度间关系的定律第三节紫外可见分光光度法的定量分析1、透光率和吸光度入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It，反射光强度为IrI0

＝Ia+It+Ir被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0＝

Ia+It透射光的强度It与入射光的强度I0的比值称为透光率(T)透光率愈大，溶液对光的吸收愈少。透光率的负对数称为吸光度(A)吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多。

1760年，Lambert指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正比。A=k1·b

1852年，Beer指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。A=k2·c将Lambert定律和Beer定律合并起来，就得到Lambert-Beer定律。A=K·b·c2、光的吸收定律

(Lambert-Beer定律)A=K·b·c

c：物质的量浓度(mol·L-1)

b：为液层厚度(cm)

K:吸光系数。应用的条件：入射光必须是单色光；吸收发生在稀的均匀的介质中；吸收过程中，吸收物质互相不发生作用。3、吸光系数其数值的大小，与物质的性质、入射光波长、溶剂种类及溶液温度等因素有关。当波长等其他因素一定时，只与物质的性质有关。两种表示方法：

a：质量吸光系数(L·g-1·cm-1)；：摩尔吸光系数(L·mol-1·cm-1)。特点：不随浓度和液层厚度的改变而改变，作为定性鉴别的参数；在max处的摩尔吸光系数，常用max表示，。不同物质的λmax有时可能相同，但εmax不一定相同，作为定性的依据；max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高例：Cd2+浓度为140umol·L-1

，双硫腙法显色测定波长为520nm，液层厚度2cm，吸光度为0.22，求和T。解：(1)

A=bc

0.22=

214010-6

=785.7L·mol-1·cm-1(2)A=－lgT

=0.22

lgT=－0.22

T=10－0.22

=0.60=60%[例]一有色溶液的浓度为cmol/L，透光率为T

。求浓度为原来的1/2时，透光率为多少？解：

T=10-bc

cT

[例]有色溶液的液层厚度增加一倍后，透光率和吸光度的改变为多少？解：

T=10-bc

bTA

1/2cT

1/2T22A2b4、对朗伯—比耳定律的偏离标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。1.非单色光引起的偏离abA2A1A3A4123A正偏离负偏离Ac标准曲线非单色光的影响（1）物理性因素

单色光不纯，导致负偏差。

散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿（非平行入射光）产生正偏差为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。(2)化学性因素吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生负偏差，朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（C<10-2mol/L)。

平衡效应：溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。

例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。

１．朗伯－比耳定律：A=abc。其中符号c代表

b代表当c的单位为mol/L，b的单位为cm,则a以符号

表示，并称为有色物质的浓度光通过有色溶液的厚度摩尔吸收系数。

２符合朗伯－比尔定律的某有色溶液当浓度为Cg·mol-1时，透光度为T0、吸光度为A0；若浓度减小一倍，则此溶液的透光度为，吸光度为。T01/20.5A03.下列说法中正确的是（）A.当溶液浓度变大时其最大吸收波长变长；B.当波长固定时，被测溶液浓度变小时，其吸光度也变小；C.吸收池厚度增加一倍，其摩尔吸光系数缩小一倍；D.标准曲线的斜率越小，说明检测的灵敏度越高。B4.已知某波长的单色光经过液层厚度为1.00cm的吸收池后，吸光度为0.19，求该溶液的透光率。5.若将某波长的单色光通过液层厚度为1.00cm的溶液，则透过光强度为入射光强度的1/4，问当该溶液液层厚度为2.00cm时，透光率（T）和吸光度（A）为多少？

（T=65%）（A2=2A1=1.20，T2=(T1)2=1/16）

根据Lambert-Beer定律，以该物质吸收光谱图中的λmax为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cs，测其As，再将样品溶液推入光路，测其Ax

，则试样溶液的浓度cx为：此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。二、紫外可见分光光度法的定量方法1.单一组分的测定（1）标准对照法06:22:11例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度（单位ug/mL)1）对照法

⑴测定步骤

①首先配制一系列被测物的标准溶液，测其吸光度，绘出A-c工作曲线；②在相同条件下，测出被测物的吸光度Ax;③根据Ax的值在工作曲线上查处cx的大小。⑵适用范围大批重复试样的分析。（2）标准曲线法(工作曲线法)未知物的吸光度未知物的浓度2、多组分的定量方法三种情况：（1）两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量令E=εb（2）．两组分吸收光谱部分重叠

λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca06:22:11步骤：（3）．两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。63第四节紫外可见分光光度法的条件选择1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之间(调c,b,)一、试样浓度的选择：最佳值最佳读数范围二、入射光的波长的选择“吸收最大max

，干扰最小”AXmaxY(2)三、显色条件的选择1.显色剂的选择

1.灵敏度高，选择性好。（一对一）

Cu~NH3

e620=1.2×102

Cu~双硫腙

e533=5.0×1042.显色产物组成恒定,性质稳定。

3.显色产物与显色剂色差大,显色时颜色变化明显.试剂空白值小。

4.显色条件要易于控制，以保证其有较好的在线性。

2.显色剂的用量（由实验确定）

M+R

=MR

(被测组分)(显色剂)(有色化合物)R过量,反应完全,MR稳定,A值稳定.

AAACRCRCRabab000A与CR关系图选择曲线变化平坦处。显色剂用量过量、适量、定量。

3显色温度、时间适宜的显色时间和温度由实验确定（曲线平坦部分对应的时间和温度就是测定吸光度的最适宜时间）

At25℃50℃t/minA四、酸度的选择OH-酸度的影响副反应M+nR=MRnH+存在型体的变化RH=R-+H+

生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸(ssal)–Fe3+pH=2~3FeR紫红色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黄色

pH>12Fe(OH)3

沉淀pH1<pH<pH2选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区ApH五.干扰离子的影响及其消除方法A、控制溶液酸度B、加入掩蔽剂C、利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态D、利用校正系数E、利用参比溶液F、选择适当的波长G、增加显色剂用量H、采用适当的分离方法，分离干扰离子

E.参比溶液(空白溶液)在测定时用空白溶液调节仪器A=0(T=100%),以消除溶液中其它物质的干扰,抵消比色皿对光反射、吸收.1)溶剂参比

试液、试剂、显色剂均无色(无吸收)

则可用溶剂如纯水作参比溶液.

2)试剂参比试液无色,显色剂或其它试剂有色(有吸收),则应选试剂空白.3)试液参比试剂、显色剂均无色(无吸收),试液中其它组分有色,则应采用不加显色剂的试液作参比溶液.选择参比溶液的总原则是:使试液的吸光度能真正反映待测组分的浓度.06:22:11例1．取咖啡酸，在165℃干燥至恒重，精密称取10.00mg，加少量乙醇溶解，转移至200mL容量瓶中，加水至刻度线，取此溶液5.00mL，置于50mL容量瓶中，加6mol/L的HCL4mL，加水至刻度线。取此溶液于1cm比色池中，在323nm处测定吸光度为0.463，已知该波长处的，求咖啡酸百分含量。解：1、双光束分光光度计与单光束分光光度计相比，其突出优点是()(1)可以扩大波长的应用范围(2)可以采用快速响应的检测系统(3)可以抵消吸收池所带来的误差(4)可以抵消因光源的变化而产生的误差1、双光束分光光度计与单光束分光光度计相比，其突出优点是()(1)可以扩大波长的应用范围(2)可以采用快速响应的检测系统(3)可以抵消吸收池所带来的误差(4)可以抵消因光源的变化而产生的误差2、双波长分光光度计的输出信号是()(1)试样吸收与参比吸收之差(2)试样在1和2处吸收之差(3)试样在1和2处吸收之和(4)试样在1的吸收与参比在2的吸收之差

3、物质的颜色是由于选择性地吸收了白光中的某些波长所致，CuSO4

溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的（）

(1)蓝色光(2)绿色光

(3)黄色光(4)红色光2、双波长分光光度计的输出信号是()(1)试样吸收与参比吸收之差(2)试样在1和2处吸收之差(3)试样在1和2处吸收之和(4)试样在1的吸收与参比在2的吸收之差

3、物质的颜色是由于选择性地吸收了白光中的某些波长所致，CuSO4

溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的（）

(1)蓝色光(2)绿色光

(3)黄色光(4)红色光2、双波长分光光度计的输出信号是()(1)试样吸收与参比吸收之差(2)试样在1和2处吸收之差(3)试样在1和2处吸收之和(4)试样在1的吸收与参比在2的吸收之差

3、物质的颜色是由于选择性地吸收了白光中的某些波长所致，CuSO4

溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的（）

(1)蓝色光(2)绿色光

(3)黄色光

(4)红色光5、KO4法氧化Mn2+到MnO4－，然后用分光光度法测定，选择合适的空白为（）

(1)蒸馏水(2)试剂空白

(3)除