山茶组织培养体系的建立me

山茶花组织培养体系的建立主讲：小组人员：李小龙、付正红、孔博、赵余庆、唐敬伟、潘海军、石春美、杨文祥《山茶》

宋陆游

东园三月雨兼风，桃李飘零扫地空。唯有山茶偏耐久，绿丛又放数枝红。

经分析我国茶花业发展现状和存在的问题,为适应市场需要，那么使用组织培养这种快速繁殖方式是一定的。就此，我们小组重点介绍山茶花组织培养的过程和在组织培养过程中存在的问题及解决方法。

一、山茶花简介山茶花为山茶科山茶属常绿灌木或乔木,乔木类树高可达12m,别名茶花、耐冬、晚山茶、川茶,产地有中国、朝鲜、日本等,但大多数产于中国。山茶花花朵大,花色丰富艳丽,在国际花卉界享有盛名,与著名的观赏花卉如月季、菊花等同属世界级名花,深受各国人民的喜爱。山茶花的一些种类还是重要的用材树种、油料植物和饮料植物。近年来,一些山茶属植物的药用保健功能得到越来越深入广泛的开发利用。山茶花传统的繁殖方法主要有播种、嫁接、扦插及压条等方式,但因其生根较困难和繁殖率低等原因,很难满足山茶属植物苗木市场的需要。特别是一些名贵或珍稀的品种类型,由于其育性差,一般不结种子,扦插繁殖生根率很低,严重制约了山茶花的发展。因此,山茶花种苗的组织培养快速繁殖被认为是一种可以大大提高繁殖系数和加速山茶花种植发展的技术方法,且对一些优良品种和珍稀品种的保护具有重要意义。二、山茶花的组织培养

1、培养材料的选择选择成年山茶花的茎尖与带芽茎节段

2、初代培养（诱导愈伤组织）

①配制分生培养基：WPM培养基＋1毫克／升BA＋0.01毫克/升IBA，PH5.2。

②外植体预处理：从成年山茶树冠的顶部剪取着生叶芽的一年生枝条，采下的枝条进行水插，置于生长室中，促使叶芽萌发为嫩梢，在嫩梢长2～4厘米时切下作外植体。也可在4～5月在同株树上取相同长的当年嫩梢直接作外植体。外植体处理：把试验材料切成长2～3cm的带芽或茎尖的嫩茎段,用洗衣粉水刷洗材料表面的污垢后,流水冲洗干净备用。

③表面消毒：嫩梢先用70％酒精浸泡30秒，接着在5％的次氯酸钙溶液中浸泡5分钟，无菌水冲洗3次，时间分别为30秒、20秒、10秒。然后将其切成长1~1.15cm的节段，作为初代外植体。

④接种：将在超净工作台上消毒灭菌处理后的外植体接种于相应培养上，放置于光照培养箱中诱导愈伤组织形成。3、继代培养

（1）配制继代培养基：WPM培养基+2毫克/升BA+0.01毫克/升IBA+2毫克/升ZT+2毫克/升2iP+30克/升蔗糖+6克/升琼脂，PH=5.2。

（2）在超净台上将愈伤组织转接于继代培养基上，放置在光照培养箱中诱导芽的形成。

（3）在培养过程中应控制褐化的发生。减少褐化的方法：用1‰抗坏血酸处理茎段及芽尖外植体、在培养基中加入一定比例的活性碳、在茎段外植体行接种前再剪去一部分茎段、对外植体勤转瓶等措施茎段外植体在黑暗条件下培养,用1‰抗坏血酸处理茎段及芽尖外植体、在培养基中加入一定比例的活性碳、在茎段外植体行接种前再剪去一部分茎段、对外植体勤转瓶等措施。

4、生根培养

（1）配制生根培养基：大量元素减半的WPM培养基，并且培养基中不含生长调节物质（植物激素及人工和成的激素类似物）（或者：茎尖为材料，诱导、继代（丛生芽）培养基为MS+BA2.5mg/l（以下单位同）+IAA1.5，生根：1/2MS+IBA0.5或1/2MS+NAA4-8，添加水解酪蛋白分化效果更好。）

（2）将长出芽的愈伤组织转接于生根培养基上，光照处诱导根的形成。培养条件：温度：昼25℃，夜18℃；光周期：每天16小时光照，光照度3000勒克斯。

5、操作过程

为了获得适合于增殖的培养体，在一个月内将外植体转移到相同成分的新鲜的培养基上3次，这对于诱导外植体产生愈伤组织、脱分化、诱导分化出芽是有必要的。在转入增殖培养基4周后，将培养体转移到新鲜培养基上进行继代培养，新鲜培养基中除BA，ZT和2ip的浓度减至1毫克/升外，其它成分相同。更换新培养基的工作一般每4周进行一次。在增殖芽从增殖培养基转移到生根培养基上之前，先将增殖芽的基部在1克/升的铁IBA溶液中浸泡15分钟，在接种到生根培养基上后，先将其放在黑暗条件下12天，进行暗处理。

6、炼苗和移栽

总的来说，当试管苗长出根但尚未老化前，打开瓶盖放在阳光充足处让其锻炼1～2天，然后取出幼苗用温水将琼脂洗掉，移栽到消毒过的基质中。移栽时要注意不要伤根并使其处于伸展状态，浇透水后，用塑料薄膜覆盖，保持空气的相对湿度在90％以上，温度在25℃左右，过一星期后逐步通气并浇灌适量的水。（1）炼苗

：将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。（2）移栽移栽时应注意的问题a、防止菌类滋生①苗底部培养基要洗干净

②杀菌剂处理苗的根部

③定时用杀菌剂处理种植基质b、保持小苗水分供给平衡

在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件（90%），使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。

c、移栽时选择合理的种植基质

基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭、锯木屑等。d、注意一定光照，温度条件

试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18—20℃，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。

7、观察项目

在实验中记录涉及内容如下：

①接种的数量和日期。

②培养过程中是否出现污染、坏死、褐化，以及出现的时间、数量。

③愈伤组织胚状体不定芽腋芽出现的时间诱导率以及生长情况。8、组织培养注意事项

（1）培养材料的选择，需要选择生长较好的材料。（2）植物材料的灭菌，要根据不同的材料来确定，材料允许的话，可以设计实验取得最佳的灭菌处理。（3）培养基的配置。要根据不同的材料，不同的物种，选择合适的培养