第二章基因工程概论

基因工程GeneEngineering【部分参考资料】

基因工程，楼士林等编著，科学出版社，2002年基因工程概论，张惠展，华东理工大学出版社，2005年基因工程，李立家、肖庚富编著，科学出版社，2004年基因操作原理，瞿礼嘉、顾红雅译，高等教育出版社，2003年基因克隆和DNA分析，魏群等译，高等教育出版社，2003年……当今世界重大问题：人口膨胀食物短缺能源匮乏疾病猖獗环境污染生态失衡生物物种消亡问题的解决依赖于现代生物技术!饥饿和肥胖是一个全球性的问题，目前地球上仍有超过10%，全世界约有8亿人处于饥饿状态，与此同时，有10亿人处于超肥胖状态，这一对数字的对比是如此鲜明。在世界上所有国家，肥胖与饥饿、贫困与富有之间的矛盾正变得日益尖锐。

拉吉·帕特尔曾经为世界银行工作，在世界贸易组织实习，为联合国提供咨询;但现在他投身于反对他的这些前雇主的国际运动中去。目前，他受聘为南非夸祖鲁-纳塔尔大学研究员，是加州大学伯克利分校非洲研究中心的访问学者。他先后获得牛津大学文学学士学位和伦敦经济学院硕士学位，最后在康奈尔大学获得发展社会学博士学位。2008年7月18日，在美国纽约联合国总部，联合国秘书长潘基文（左）在联大全会上与联大主席克里姆交谈。第62届联合国大会18日就全球粮食和能源危机问题举行特别会议，讨论如何加强国际合作与协调，以应对粮食和能源价格上涨所带来的挑战。

生物燃料战略是一个错误?德国民间机构“粮食监督委员会”干事长蒂罗·博德认为，“生物燃料战略是一个威胁人类生存的错误”，主张停止生产生物燃料。专家指出，一方面，全球粮食储备已从2010年的1.75亿吨下降到目前的1亿吨。另一方面，生物燃料每年却要“吃掉”1.5亿吨粮食。如果停止其生产，全球就有足够的粮食储备，粮价也不会暴涨。光明日报维也纳2012年9月5日电美国汽车从人畜嘴里抢粮！

基因工程是现代生物技术的核心动植物改良生物制药蛋白质工程组织工程代谢工程细胞工程基因工程美科学家首次提出:

人类智商和基因有关美科学家培育出

首个转基因人类胚胎第一章绪论

基因工程概况教学目的和要求：掌握基因工程的基本概念熟悉基因工程的基本原理和过程了解基因工程的发展历史和重要成就

第一章绪论

基因工程概况第一节基因工程的诞生

第二节基因工程的成就

第三节基因工程研究的内容

第一节基因工程的诞生

理论与技术支持理论上的三大发现：①证明了生物的遗传物质是DNA②DNA的双螺旋结构和半保留复制机理③中心法则和三联体密码子系统的建立（1）肺炎双球菌转化实验（2）噬菌体转染实验DNA是遗传物质DNA双螺旋结构DNA半保留复制机理中心法则DNA

RNA

protein三联体密码子系统

第一节基因工程的诞生

理论与技术支持技术上的三大发现：①限制性内切酶和DNA连接酶的发现②载体的使用③逆转录酶的发现限制性内切酶的发现DNA连接酶的发现载体的使用

逆转录酶的发现

第一节基因工程的诞生

发展简史

第一个实现DNA重组的实验①1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组

②对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体的DNA进行重组

③“在任何时候，创新性的思维都是最宝贵的。”

P.Berg

1980年，获Nobel化学奖第一节基因工程的诞生

发展简史

第一次实现重组体转化成功的实验

①1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式

②对猿大肠杆菌的抗四环素的质粒PSC101和来自鼠伤寒沙门氏菌的抗链霉素和磺胺的质粒RSF1010进行重组表达标志着基因工程的诞生

Cohen和Boyer的实验StanleyCohen

1986年，获Nobel生理或医学奖HerbBoyer

世界上第一家利用重组DNA技术

制造蛋白质用于治疗人体疾病的公司（Genentech）全球十大生物技术公司

※全球生物技术公司的领头羊—美国安进公司（Amgen）※丹麦诺和诺德公司（NovoNordisk）※生物技术产业领域的探路先锋—美国基因技术公司（Genentech）※

Serono公司—意大利罗马※

Biogen公司—瑞士日内瓦※

Chiron公司—美国※

Genzyme公司—美国※

Immunex公司—美国※MedImmune公司—美国※CSL公司—澳大利亚第二节基因工程的成就1972-1976年，日本，somatostatin（生长抑素）1978年，美国，生长激素基因（HGH）1980年，美国/瑞士，a干扰素－基因1984年，日本，白细胞介素2（IL-2）1982年，美国，大鼠生长激素基因转入小鼠1983年，美国，Ti质粒导入植物细胞1990年，美国，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID）1991年，美国倡导，人类基因组计划1997年，美国人，威尔英特克隆多利绵羊

……

第三节基因工程研究的内容

1、什么是基因工程？

按照人们事先设计的蓝图，在体外将不同来源的DNA分子进行剪切重组，与载体DNA形成镶嵌DNA分子（即重组DNA分子），然后将之导入宿主细胞，使之在宿主细胞中扩增表达，从而使宿主或宿主细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物（刘祖洞，《遗传学》）。第三节基因工程研究的内容

1、什么是基因工程？

专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒和噬菌体等）的DNA结合成一个重组的复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞，生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物（贺淹才，《简明基因工程原理》）。

第三节基因工程研究的内容

1、什么是基因工程？

在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物地新性状，并能稳定地遗传给后代。(李立家，肖庚富，《基因工程》)

第三节基因工程研究的内容

1、什么是基因工程？

按人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（DNA分子），在体外构建成杂种分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。因此，人类利用基因工程技术，就有可能根据需要，通过体外重组，跨越生物种属间的屏障，改变生物原有的遗传特性，定向培养或创造新的生物品种（程备久，《现代生物技术概论》）。

第三节基因工程研究的内容

2、相关名词术语遗传工程（Geneticengineering）基因工程（Geneengineering）基因操作（Genemanipulation）重组DNA技术（RecombinantDNAtechnique）基因克隆（Genecloning）基因修饰（Geneticmodification）分子克隆（Molecularcloning）遗传工程和基因工程的差别

遗传工程是指以改变生物有机体性状特征为目标的遗传信息量的操作（themanipulationoftheinformationcontent），它既包括常规的选择育种，也包括相对复杂的基因克隆等不同技术层次。第三节基因工程研究的内容

3、理论依据不同基因具有相同的物质基础基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代第三节基因工程研究的内容

4、基本技术路线第三节基因工程研究的内容

5、主要内容①从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）；②用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简称接）；③借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称转）；④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增）；⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。第三节基因工程研究的内容

6、基本要素基因工具酶载体受体细胞第二章基因克隆所需的工具酶

教学目的和要求：掌握各种工具酶的基本特性

熟悉工具酶的使用方法和注意事项酶是DNA重组技术中必不可少的工具基因工程中所用的酶统称为工具酶。

工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶

第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）核酸酶=核酸外切酶（exonuclease）

+

核酸内切酶（endonuclease）限制性核酸内切酶的定义又简称限制酶或内切酶，一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键，从而切断双链DNA的核酸水解酶。第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）一、限制性核酸内切酶的发现细菌细胞的限制—修饰体系1978年，W.Arber、H.O.Smith&D.Nathans获诺贝尔生理学或医学奖首批被发现的包括来源于大肠杆菌的EcoRI和EcoRII，以及来源于Heamophilusinfluenzae的HindII和HindIII“带剪刀的仆人”的故事——瑞士微生物遗传学家W·阿尔伯（1929－）的女儿西尔维娅讲述

第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）二、限制性核酸内切酶的类型按功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，分成三类：I、II、III类无用广泛应用用处不大通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）三、限制性核酸内切酶的命名法分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶H．O．Smith和D．Nathans（1973年）提议的命名系统，已被广大学者所接受一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株（品系）属名+种名+株名BacillusamyloliquefaciensHHaemophilusinfluenzaedⅠ→BamH

→

HindⅠ第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性内切酶的基本特性1、识别特定的核苷酸序列识别长度一般为4~8bp具有回文序列(palindrome)

＝6个（大多数）：如EcoRⅠ5’-GAATTC-3’<6个：如AsuⅠ5’-GGNCC-3’（5个）

MboⅠ5’-GATC-3’（4个）>6个：如NotⅠ5’-GCGGCCGC-3’（8个）识别序列有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内

如：Sau3A识别：GATCBamHⅠ识别：GGATCC有的限制酶识别多种核苷酸序列如：HindⅡ识别4种核苷酸序列：

5’-CTPyPuAC-3’（Py→嘧啶碱基C或T；Pu→嘌呤碱基A或G）各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构限制酶：BamHⅠGGATCCCCTAGG5’3’5’3’正读与反读都相同以识别序列的中线为对称轴，左右两侧碱基互补为便于书写，识别序列可以以5’→3’走向的单链DNA表示第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性内切酶的基本特性2、具有特定的酶切位点第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性内切酶的基本特性3、切割类型两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心T第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性内切酶的基本特性4、切割频率P=（1/4）nn：酶识别的碱基数。切点数目＝分子大小（碱基对数）×识别序列频率第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性内切酶的基本特性5、同裂酶（isoschizomers）有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。（a）切点位置相同GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ（a）切点位置不同CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性内切酶的基本特性6、同尾酶（isocaudamer）这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”（hybridsite）。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BglⅡAGATCTTCTAGAATCTAG

GATCTA第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性内切酶的基本特性7、稀切酶有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶。基因操作中使用稀切酶可获得大的片段。

第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）五、影响核酸内切限制酶活性的因素

1、DNA的纯度

2、DNA的甲基化程度

3、酶切消化反应的温度

4、DNA的分子结构

5、核酸内切限制酶的缓冲液

DNA的纯度污染在DNA制剂中的蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸钠）以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。

DNA的纯度

提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用3种方法：①增加核酸内切限制酶的用量②扩大酶催化反应的体积③延长酶催化反应的保温时间DNA的甲基化程度

识别序列中特定核苷酸的甲基化作用会强烈地影响酶的活性。

酶切消化反应的温度

不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有例外的情况

DNA的分子结构

切割线性分子的效率明显高于切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA识别序列的侧面序列位点偏爱性

核酸内切限制酶的缓冲液标准缓冲液组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等

星性（Star）活性某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同

星性（Star）活性控制反应条件，避免Star活性（避免高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等诱导条件）第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）六、利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤

※建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作

※不同限制酶的缓冲液主要差别在于其中所含NaCl的浓度第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）六、利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤

①将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18μ1；②加入2μl适当的10×限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁以混匀之；③加入1~2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀；④将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育；⑤酶切反应的终止⑥酶切结果分析第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）七、使用限制酶的注意点

①小心取用，节省开支

；②操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短

；③尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小

；④通常延长消化时间可使所需的酶量减少

第一节限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）八、DNA分子片段化

1、单酶切法

2、双酶切法

3、部分酶切法现有一长度为1000碱基对（bp）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用Kpn1单独酶切得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同时酶切后得到200bp和600bp两种长度的DNA分子。第二节DNA连接酶一、DNA连接酶的发现

1967年，世界上有多个实验室几乎同时而且独立地发现。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。

第二节DNA连接酶二、DNA连接酶的连接机理(演示)

一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。如果是两个或两个以上不同的双链DNA片段末端连接，则产生重组DNA分子。

第二节DNA连接酶三、常用的DNA连接酶1、E.coli

DNA连接酶

催化片段互补黏性末端之间的连接以NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一种转递电子的辅酶）作为辅助因子

第二节DNA连接酶三、常用的DNA连接酶2、T4DNA连接酶

不仅能催化片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA平末端之间的连接以ATP（腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷）作为辅助因子

第二节DNA连接酶三、常用的DNA连接酶3、TscDNA连接酶

一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的核酸酶连接酶链反应（ligasechainreaction，LCR）

第二节DNA连接酶四、DNA片段的连接方法

1、互补黏性末端片段之间的连接

既可用大肠杆菌DNA连接酶，也可用T4DNA连接酶同种限制酶切开连接后保留原有切点；同尾酶切开连接后失去原有的两种限制性酶的识别序列

第二节DNA连接酶四、DNA片段的连接方法

2、平末端片段之间的连接

只能用T4DNA连接酶，但要增加酶用量同种限制酶切开连接后保留原有切点；同尾酶切开连接后失去原有的两种限制性酶的识别序列有的新连接片段还可能形成新的限制酶切位点

第二节DNA连接酶四、DNA片段的连接方法

3、片段末端修饰后进行连接

DNA片段末端同聚物加尾后连接黏性末端修饰成平末端后连接

DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接DNA片段加连杆后连接DNA片段末端同聚物加尾后进行连接黏性末端修饰成平末端后进行连接DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接DNA片段加连杆后连接寡核苷酸连杆（linker）是一种按预先设计化学合成的寡核苷酸片段，一般由8-12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。DNA片段加连杆后连接设计合成的另一类寡核苷酸连杆由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别序列，可作为连杆且被组装在克隆载体上成为多克隆位点（MCS），这种连杆即多克隆位点寡核苷酸连杆或简称MCS连杆。DNA片段加连杆后连接衔接头（adaptor）是一类人工合成的一类具有一种以上的限制酶粘性末端的寡核苷酸短片段。与连杆的重要区别是合成的衔接头的一端或两端已具有一种或两种限制酶切割产生的黏性末端。

第三节DNA聚合酶DNA聚合酶以DNA为复制模板，从DNA由5‘端点开始复制到3’端的酶。常用的DNA聚合酶有：耐热性DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow酶、T4DNA聚合酶等。

第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I

第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I

1、5′→3′的聚合酶活性

①dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）和Mg2+离子

②带有3′-OH游离基团的引物链③DNA模板，它可以是单链的，也可以是双链的

第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I

2、5′→3′的核酸外切酶活性

①从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸，切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸

②通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I

3、3′→5′的核酸外切酶活性

※从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸第三节DNA聚合酶二、Klenow片段

※大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（klenow片段），又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶※作为商品提供的klenow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶Ⅰ而产生或者通过克隆技术而得到的单一多肽

Klenow聚合酶的主要用途

①补平限制性内切酶切割DNA产生的3′凹端；②用[32P]dNTP补平3′凹端，对DNA片段进行末端标记；③对带3′突出端的DNA进行末端标记；④在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；⑤在体外诱变中，从单链模板合成双链DNA；⑥应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序。⑦也用于PCR反应进行体外扩增基因DNA序列，但已经被TaqDNA聚合酶代替。第三节DNA聚合酶三、T4DNA聚合酶※从一种携带有高表达T4DNA聚合酶质粒的大肠杆菌中提纯制备※具有5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切核酸酶活性

T4DNA聚合酶的主要用途

①补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的3′凹端，②对带有3′突出端的DNA分子进行末端标记；③标记用作探针的DNA片段。④将双链DNA的末端转化成为平端，⑤使结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸。

外切酶活性

聚合酶活性

无dNTPdNTP5’CAGCAACGT

3’dATPCAGCAACGT3’S1T3’3’GTCGTTGCA5’T4聚合酶

A5’A5’第三节DNA聚合酶四、耐热DNA聚合酶

※从嗜热的水生菌Thermusaquaticus中纯化来的，现在以基因工程生产并出售（AmpliTaqTM）※分为三类：普通耐热DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA序列测定耐热DNA聚合酶

耐热DNA聚合酶的主要用途

①DNA测序

②聚合酶链式反应（PCR）对DNA片段进行体外扩增第三节DNA聚合酶五、逆转录酶

※又称RNA指导的DNA聚合酶，是以RNA为模板合成DNA的酶

※有两种已经商品化：一种来自纯化的成骨细胞性白血病病毒（AMV）；另一种是来自Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）。

逆转录酶的主要用途

①以mRNA为模板合成cDNA，是反转录酶的最主要的用途

②利用其5‘→3’外切酶活性，标记带5‘突出末端的DNA片段

③当其他酶用于双脱氧链终止法测序效果不理想时，则可试用反转录酶

5’AAAAA3’引物

5’AAAAA3’

TTTTT5’

反转录反应

5’3’5’3’3’5’3’5’

全长cDNA提前终止反应

第四节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶

※简称末端转移酶，能够催化5′脱氧核苷三磷酸进行5′→3′方向的聚合作用※不需要模板存在就可以催化DNA分子发生聚合作用第四节DNA修饰酶二、碱性磷酸酯酶

※细菌碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，简称BAP）；小牛肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，简称CIP）※使DNA（或RNA）片段的5′-P末端转换成5′-OH末端第四节DNA修饰酶三、T4多聚核苷酸激酶

※从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来※催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端第四节DNA修饰酶四、甲基化酶

※可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤※5’-甲基胞嘧啶（Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5

位置上引入甲基）

※6’-甲基腺嘌呤（Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6

位置上引入甲基）

第四节DNA修饰酶四、甲基化酶

※常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同如：M.EcoRIGAmATTCC

EcoRIG

AATTC不同

M．HpaICmCGG

HpaICCGG相同

对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶识别序列*甲基化酶AvaⅡGG(A/T)CC(A/T)GG

dcmBclⅠTGATCAdamClaⅠGATCGATdamEcoRⅡCC(A/T)GG

dcmHphⅠGGTGATCdamMboⅠGATCdamNruⅠGATCGCGAdamSau96ⅠGGNCC(A/T)GG

dcmSauFⅠCC(A/T)GG

dcmStuⅠAGGCCTGG

dcmTagⅠGATCGAdamXbaⅠTCTAGATCdam*下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列

甲基化对限制酶切的影响①修饰酶切位点

②产生新的酶切位点

③对基因组作图的影响（使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切）

第三章基因克隆的载体

教学目的和要求：了解各种载体一般生物学特性

学会看懂质粒图，掌握各种载体的用途把一个有用的目的的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体

能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体（vector）多数载体是DNA分子，但某些RNA分子也能用做载体。

按构建克隆载体DNA的来源分类①质粒载体②噬菌体载体③病毒载体④质粒与病毒或噬菌体DNA组成的载体⑤质粒与染色体DNA片段组成的载体⑥其它克隆载体

按克隆载体的用途分类①cDNA克隆载体②转录载体③表达载体④普通载体

按应用对象分类①原核生物基因克隆载体②酵母基因克隆载体③植物基因克隆载体④动物基因克隆载体

理想的克隆载体具备的基本条件

①针对受体细胞的可转移性

②自主复制功能

③多种且单一的限制性内切酶切点

④容易检测的筛选标记

⑤载体的分子量适当

⑥在细胞内稳定性高

第一节质粒载体一、质粒的一般生物学特性

※质粒是一种广泛存在于细菌细胞中染色体以外的能自主复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。※在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入。第一节质粒载体一、质粒的一般生物学特性

※质粒的组成与构型细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子细胞外：超螺旋、开环，线形双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）l-DNAoc-DNAccc-DNA构型：第一节质粒载体一、质粒的一般生物学特性

①自主复制性②不亲和性

③可转移性④显性质粒和隐蔽质粒

第一节质粒载体①自主复制性

质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．

第一节质粒载体①自主复制性

每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定

严紧型质粒：1~数个拷贝松驰型质粒：10个以上拷贝A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积累到足以阻止质粒的复制．B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同一宿主细胞中．D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr．F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）．G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．H）致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。rep基因：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制第一节质粒载体②不亲和性

不亲和性是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

第一节质粒载体②不亲和性

亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒

不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒

第一节质粒载体③可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。

第一节质粒载体③可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。

第一节质粒载体③可转移性含tra基因的质粒称为接合质粒。不含tra基因的质粒称为非接合质粒。质粒的迁移作用第一节质粒载体④显性质粒和隐蔽质粒宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。反之称为隐蔽质粒。显性质粒：Ｒ质粒、Col质粒、Ｆ质粒、降解质粒、Ｔi质粒。隐蔽质粒：蓝藻内源质粒

第一节质粒载体二、质粒克隆载体构建的基本策略

能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝）克隆位点——组装MCS连杆选择标记基因——抗性基因，LacZ’基因分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓组装各种“元件”，如启动子、终止子等第一节质粒载体三、质粒克隆载体构建

※构建过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）

第一节质粒载体三、质粒克隆载体构建

※构建原则

：选用合适的出发质粒正确获得构建质粒克隆载体的元件组装合适的选择标记基因选用合适的启动子构建过程力求简单质粒DNA的分离与纯化

常用的有：氯化铯－溴化乙锭密度梯度离心法、碱变性法、煮沸裂解法、羟基磷灰石柱层析法、酸酚法、两相法等

氯化铯密度梯度离心法

首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解；将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去；在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。碱变性法

在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。①取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；②加入100微升冰冷的溶液，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA，4~5mg溶菌酶）静置5分钟；③加入200微升微冷的溶液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。（65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。）④加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。⑤离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。第二节大肠杆菌质粒载体一、质粒pBR322

※质粒ColE1衍生的pMB1作为出发质粒

※pSF2124+pSC101+ColE1=pBR322质粒载体

优点

①具有较小的分子量，容易纯化

②具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号③具较高的拷贝数

④对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点

第二节大肠杆菌质粒载体二、pUC质粒载体

※1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322和M13基础上构建的

优点

①具有更小的分子量和更高的拷贝数

②适用于组织化学法检测重组体

③具有多克隆位点区段（MCS）

第二节大肠杆菌质粒载体三、pGEM系列载体

※由pUC派生而来

※与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6

特点

①如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA

②外源基因正接反接都可以转录

③MCS与pUC18的完全一样第三节病毒（噬菌体）载体※病毒基本结构：

DNA（或RNA）+外壳蛋白感染细菌的病毒，称为噬菌体。第三节病毒（噬菌体）载体※分类（根据病毒与宿主关系）：

温和性病毒：

溶原性增殖→构建病毒载体

烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后构建病毒载体※噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期，只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6、释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来噬菌体的溶源生命周期：溶源生长周期：

是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。现知只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期λ噬菌体（一）λ噬菌体性质①组成：

λDNA+外壳蛋白λDNA(48.5kb)噬菌体中：线性宿主细胞：环状(cos位点)λ噬菌体（一）λ噬菌体性质②是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。

λ噬菌体（一）λ噬菌体性质③复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制

λ噬菌体（一）λ噬菌体性质④基因组成

λDNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段λ噬菌体（二）λ噬菌体载体的构建依据

1、λ噬菌体是一种温和噬菌体2、能承载较大的外源DNA片段

λDNA头部可包装约36.4～51kb（自身的75%～105%），且约有20kbλDNA可缺失（生长非必需）3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点λ噬菌体（三）构建的基本策略与技术路线

策略：切去部分非必需区删掉多余的限制性内切酶位点插入选择性标记基因建立体外包装系统。λ噬菌体（三）构建的基本策略与技术路线

技术路线

：①用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点

λ噬菌体（三）构建的基本策略与技术路线

技术路线

：②在λDNA的非必需区内插入选择标记基因

最常用的筛选标记：LacZ基因λ噬菌体（三）构建的基本策略与技术路线

技术路线

：③建立重组λDNA分子体外包装系统D-（D基因缺失噬菌体）＋E-（E基因缺失噬菌体）＝λ噬菌体λ噬菌体（四）λ噬菌体载体的类型

①插入型（Insertionvectors）一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。如：λgt10、λgt11

λ噬菌体（四）λ噬菌体载体的类型

②置换型（Replacementvectors）具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。

如Charon4载体（凯伦噬菌体载体）常用的λ噬菌体衍生载体

载体名称分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A

4.54

0–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.4M13噬菌体

（一）M13噬菌体性质①丝状噬菌体，内有一环状单链DNA分子（“+”链DNA）大小：6.4kb结构：10个区基因间隔区（IS区）含复制起始位点及可插入外源DNA的位点M13噬菌体

②复制与增殖

M13DNA“+”链进入雄性大肠杆菌→合成“-”链→产生双链M13DNA（复制型DNA或RF-DNA）→按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转录包装蛋白→RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链→结果只能以“-”链为模板合成“+”链→“+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体→挤出受体细胞→宿主细胞不被溶菌。RFDNAM13噬菌体

（二）M13噬菌体性质①在IS区内插入LacZ基因

②在标记基因区内组装MCS区段

柯斯质粒※柯斯质粒载体，又称粘粒、柯斯载体，是一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cossitecarryingplasmid的缩写。柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kbCosmid载体的特点①具有λ噬菌体的特性

②具有质粒载体的特性③高容量的克隆能力采用柯斯质粒作载体的不足①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。采用柯斯质粒作载体的不足②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析采用柯斯质粒作载体的不足③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。第四节人工染色体克隆载体

※人工染色体指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。

温和性病毒：

溶原性增殖→构建病毒载体

烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后构建病毒载体酵母人工染色体（YAC）

酵母人工染色体（YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。有酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。

pYAC4人工染色体

优点：可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。

例如，某些基因如人凝血因子VII基因长达180kb，肌营养不良基因大于1800kb．缺点：（1）克隆外源基因易出现嵌合体（2）有些克隆不稳定（3）YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离

细菌人工染色体（BAC）细菌人工染色体（BAC）是以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。BAC克隆容量可以达300kb

，可以通过电穿孔导入细菌细胞。拷贝数低，稳定，比YAC易分离。

P1派生人工染色体（PAC）P1派生人工染色体（PAC）是将BAC和P1噬菌体载体二者优点结合起来的克隆体系，可以克隆100-300kb的外源DNA片段。

含有卡那霉素抗性基因，便于筛选。在宿主细胞中以单拷贝的形式存在，避免了因多拷贝造成的不稳定。

哺乳动物人工染色体（MAC）哺乳动物人工染色体（MAC）指从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。人类游离人工染色体（HAEC）基于人类EB病毒（人类疱疹病毒）而构建的环形DNA，含有EB病毒的复制原点（oriP）和潮霉素（链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素）抗性基因。能以环形小染色体形式复制，并在有丝分裂中保持稳定。外源基因导入受体细胞重组体的筛选1、利用抗生素基因2、营养缺陷互补法3、核酸杂交4、免疫反应筛选5、酶活性筛选1.细胞质中表达2.周质中表达3.胞外表达外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位蛋白质的合成是在细胞之中进行的目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总蛋白的20%～40%。目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒，包涵体存在于大肠杆菌细胞质中在细胞内表现为可溶性的蛋白质，1.细胞质中表达形成包涵体优点：

a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离

b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用

c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞

受伤害d.蛋白质的产量高

二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧

失，会导致外源片断编码的蛋白质

在大肠杆菌中超量表达。e.表达的质粒载体构建比较简单。包涵体缺点：

a.蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可

能无法恢复其生物学活性

b.蛋白质的终产量偏低

c.蛋白质的生产成本比较昂贵

3.胞外表达：

可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌到培养液中。分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的10倍目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠蛋白质杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去

融合型异源蛋白的表达

除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白融合型异源蛋白的表达以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白表达率高与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段目的蛋白易于分离利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白溶解性好由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性据了解，美国在2000年1月~2004年12月批准的所有创新生物技术药物中，用酵母表达的有两种，用大肠杆菌表达的有6种，且都是分子量为3500~6000道尔顿的低分子量多肽。与此形成鲜明对比的是，从2000年以后，哺乳动物细胞表达系统更受美国等国家的制药公司的重视。目前，美国418种在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞（CHO）为主的哺乳动物细胞表达的。在FDA已批准上市的生物技术药物中，哺乳动物细胞表达的产品占70%以上。从销售情况来看，2005年全球生物技术药物约70%的销售额（超过365亿美元）是由