第三章-细胞工程10

第三章细胞工程23.1细胞工程的基本技术细胞工程实验室的常见设备细胞培养的基本方法33.1.1细胞工程实验室的常见设施灭菌锅电热干燥箱超净工作台倒置显微镜细胞计数板4电热鼓风干燥箱手提式高压灭菌锅立式高压灭菌锅垂直双人双面超净工作台离心机光照培养箱CO2培养箱液氮罐倒置显微镜细胞计数板5动物细胞培养中用于观察细胞的生长状况及计数。CO2培养箱（动物细胞培养）6光照培养箱（植物细胞培养）CO2培养箱主要控制模拟活体内环境相关的3个基本变量：稳定的CO2水平、温度、相对湿度。液氮罐（用于冻存培养的动物细胞）73.1.2细胞培养的基本方法

——无菌操作

细胞工程的所有试验都要求在无菌条件下进行，要求十分严格的无菌操作。

1、准备室、接种室、培养室（紫外线、熏蒸等）；

2、超净工作台、高压灭菌设备、过滤器；

3、生物材料的消毒（酒精、升汞、次氯酸钠等）；

4、试验器械、器皿的灭菌（干热、湿热）；

5、药品、培养基的灭菌（湿热、过滤）；8细胞培养技术细胞培养是指动物、植物或微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。(微生物培养、植物细胞培养、动物细胞培养)基本步骤包括：获取原材料及除菌；配制培养基，对培养基进行灭菌；接种、培养和传代。9细胞融合技术离体条件下将不同生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。——单克隆抗体细胞融合技术的主要过程：制备原生质体（植物）；诱导细胞融合（化学融合剂介导、电融合、病毒融合剂介导等）；筛选杂合细胞。10核移植用机械的办法将供体细胞的细胞核转移至另一个受体细胞（去除细胞核）中，并使这个重组细胞进一步发育、分化。——克隆羊Dolly113.2植物细胞工程12细胞的全能性(totipotence)1902年：德国植物学家哈伯兰德（Haberlandt）就预言，植物细胞具有全能性，即植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。1943年，怀特明确提出了“植物细胞全能性”学说：每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。植物细胞的全能性，是植物细胞工程创立的重要理论基础。131997年多利羊诞生证明了动物细胞全能性3.2.1几个基本概念*外植体、愈伤组织外植体：从健康植株的特定部位或组织，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。可以是器官、组织、细胞和原生质体等（如：花粉、茎段、叶片、茎尖、胚等）。愈伤组织：原指从植物的伤口部位生成的脱分化的薄壁细胞团。组织培养时,则指在培养基上从外植体上长出的一团无序薄壁细胞。它具有再分化成为完整植物体的潜能。14水稻幼胚水稻愈伤组织细胞分化、脱分化、再分化分化（diffrentiation)：细胞的形态、构造和功能发生变化，如花芽分化，木质部分化，不定胚分化；脱分化（dediffrentiation)：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化；再分化（rediffrentiation)：将脱分化的母细胞再培养成分化细胞，并且形成组织或器官以及生物体；15水稻幼胚水稻愈伤组织脱分化分化出苗再分化植物细胞培养的培养基16糖（碳源），氨基酸，维生素等水：大量元素：K,Ca,Mg,P,S等微量元素：Cl,Fe,Mn,B,Zn,Cu,Co等无机营养：蒸馏水或去离子水有机营养：生长调节物质：生长素：2，4－D，NAA，IAA等。促进根的分化细胞分裂素：6－BA，玉米素，激动素等，促进芽的分化天然附加物：椰乳，酵母提取物，麦芽浸出物等植物生长所必须的元素：大量元素（9种）：C、H、O、N、K、Ca、Mg、P、S微量元素（7种）：Cl、Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mu3.2.2组织培养的基本方法进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：171.材料的准备；2.接种与培养；3.继代增殖；4.诱导分化、生根成芽；5.移栽、炼苗成活。18水稻幼胚水稻成熟胚愈伤组织分化出苗诱导成芽诱导生根(底面观)诱导生根（侧面观）移栽、炼苗193.2.3快速繁殖技术植物快速繁殖技术（快繁）：利用组织培养方法将植物体某一部分的组织小块，进行培养并诱导分化成大量的小植株，从而达到快速无性繁殖的目的。也称为试管苗繁殖或微体繁殖。20快繁技术最早在兰花工业上获得成功。在20平方米的培养室内，最多可容纳100万株试管苗。213.2.4植物脱毒技术是植物快繁的一个分枝1952年，法国科学家首次建立了生长点培养成株的脱毒法，从而开创了防治植物病毒病的新途径。对植物病毒病迄今已采用的生物、物理、化学等多种防治途径均收效甚微，有的毫无成效。因此，过去人们只能采取拔除并消毁病株的消极方法。22原理在感染病毒的植株中，病毒的分布是不一致的。老叶片及成熟组织和器官中，病毒含量较高，但幼嫩的和未成熟的植物部位（如茎尖分生组织），病毒的含量较低，而在生长点约0.1～1毫米时，则几乎不含病毒颗粒。这是由于病毒的繁殖运输速度与茎尖细胞生长速度不同所致。在茎尖分生组织中，细胞繁殖十分迅速，病毒还来不及侵入，因此就成为植物体相对无病毒的特殊区域。23采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.1～0.5毫米带1～2个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。所取的外植体很小，分离难度大，一般在解剖镜下操作。马铃薯、洋葱、大蒜、兰花、菊花、康乃馨、水仙、唐菖蒲、香蕉、苹果、柑橘、葡萄等。24华中农大马铃薯脱毒试管苗253.2.5次生物质与植物细胞的大量培养次生代谢产物是指生物中一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。那些应用价值高，价格昂贵，资源不足，难以进行化学合成的植物次生物质，用细胞培养生产才会有经济上的效益。

261956年，提出工业化培养植物细胞以生产其天然产物。之后，用此方法生产了紫草宁、哈尔碱、麻黄碱、人参皂角苷、紫杉醇等。《本草纲目》中所开列的1892种药物中绝大多数是植物；目前约有25%的法定药品来自植物。第一个商品化的细胞大规模培养的植物是紫草。1983年，日本三井石油化学工业公司利用紫草细胞大规模培养生产紫草宁，最终浓度达1400mg/L，宣布把紫草宁作为燃料和药物进行工业化生产。在摇床扩大培养的长春花细胞27紫草我国已经建立了人参、三七、西洋参、三尖杉、紫草、洋地黄、长春花、丹参、红豆杉等40多种药用植物的液体培养系统，并对长春花、人参、紫草、红豆杉等进行大规模培养的探索。长春花28红豆杉红豆杉树皮中提取的紫杉醇对治疗卵巢癌和乳腺癌有特效。这种物质的碳环结构十分特殊，难以通过化学合成获得。然而要治好一个卵巢癌病妇，至少需要2～3棵60老龄的此种树的树皮。这种树属于稀有树种，且生长很慢，若不断取用的话，很快就要面临濒危的境地。我生物技术产物第一个商品化的例子：人参，中国药科大学组培室人参3.2.6原生质体培养与细胞融合是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。目前仍以种内和种间的细胞杂种为主。29显微镜下的细胞融合过程细胞融合的方法物理法（电）、化学法（化学融合剂）及生物法（病毒融合剂）。原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透性——随机结合、融合植物细胞融合常用PEG法和电融合法。30目前，最常用的植物细胞融合技术，有高国楠建立的使用化学融合剂PEG（聚乙二醇）的融合技术（1974），森达和乔默尔曼创立和发展的电融合技术，以及斯维格（1987）将电融合与微培养结合起来的技术。31植物原生质体融合过程3.2.7人工种子人工种子又称人造种子，这是细胞工程中最年轻的一项新兴技术。由英国科学家于1978年提出的。天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。人工种子是由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成。32体细胞胚胚不一定从受精卵发育来，尤其在植物界，往往可以看到未受精的卵细胞或胚囊细胞、珠心细胞等发育成胚的现象。由体细胞发育成的类似于合子胚的结构成为胚状体或体细胞胚，简称体胚。体胚具有两极性，可从方向相反的两端分化出茎和根。因此，体胚可以一次性再生成完整植株。把体胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。33马铃薯人工种子包埋介质海藻酸钠这种物质在0.1M氯化钙溶液中可以迅速固化成透明的小胶球。海藻酸价格低廉，质地柔软无毒性，还可人为地在其中加入各种营养物质和生长调节剂，因此是一种，迄今为止已发现的比较理想的体细胞胚包埋剂。34美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选到目前广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。三大难题有待克服①许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。②现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。③人工种子的贮藏有待进一步完善。35目前已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用还有很大距离。3.3动物细胞工程3.3.1动物细胞培养3.3.2动物细胞培养的基本过程3.3.3体外培养的动物细胞的生长类型3.3.4动物细胞培养条件3.3.5动物细胞的冻存与复苏3.3.6动物细胞培养应用363.3.1动物细胞培养动物细胞（组织）培养：从动物体内取出细胞（或组织），模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞（或组织）生存、生长并维持结构和功能。起源于19世纪所应用的某些胚胎学技术。奠基人:美国生物学家哈里森。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。37培养器具38过滤器离心管培养瓶冻存管几个概念原代培养期（10代细胞以内）传代培养期（10代细胞以后）细胞株：（10-50代细胞）细胞系：（50代细胞以后，细胞发生了癌变）39原代培养(primaryculture)把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。40过程：从动物机体中取出组织剪碎加胰蛋白酶细胞游离加培养液将细胞接种到培养瓶内培养（1—2天换一次培养液）细胞贴壁生长长成单层细胞细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。传代培养(subculture)体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。4142细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。细胞系：体外培养的动物细胞传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的pH为7.2－7.4，此环境下胃蛋白酶（最适pH2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。3.3.2动物细胞培养的基本过程43选材：多选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，因为它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。44基本过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养的细胞50代细胞细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维）遗传物质已改变3.3.3体外培养的动物细胞的生长类型离体培养的动物细胞可分为三类：贴壁依赖性贴壁非依赖性兼性贴壁细胞。45贴壁依赖性细胞动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞需有给予贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴壁因子才能在该表面上生长、增殖。这样的细胞称为贴壁细胞；当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。46接触抑制当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

正常二倍体细胞的生长寿命是有限的，而异倍体细胞无接触抑制现象，其寿命是无限的，如肿瘤细胞。4748培养中的胃癌细胞MGC-803（多层）贴壁非依赖性细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，细胞透明度较大，边缘不是那么清晰，故也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。49兼性细胞生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。3.3.4动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养要求高（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、环境要求高：温度和pH36.5+0.5度,7.2-7.44、气体环境：

O2和CO2（95%空气和5%CO2

）50保证细胞顺利的生长增殖不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。3.3.5动物细胞的冻存与复苏冷冻保存：将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。复苏：以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温。51冷冻保存方法

最常用的方法：利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70℃

～-80℃

，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。5253获得细胞或细胞产物细胞的全能性细胞株、细胞系植物个体或细胞培养结果快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较3.3.6动物细胞培养应用利用体外培养的动物细胞来大规模生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据543.4单克隆抗体长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，只能是混合抗体,产量低，特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。5556什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里？起何作用？什么是单克隆抗体？B细胞血清特异性免疫作用抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。用单个B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体3.4.1几个基本概念57传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴结B细胞一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。传统方法获得的抗体是多克隆抗体(混合抗体)58设计方案：一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖化学性质单一、特异性强，只针对一种抗原决定簇的抗体。杂合细胞单克隆抗体3.4.2单克隆抗体的制备过程591975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与用绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。60

单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体诱导其融合的方法有哪些？两次筛选分别有什么目的？为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？61杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图①动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射等如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。

62

单克隆抗体制备过程63

小白鼠免疫流程抗原混合弗氏完全佐剂进行初次免疫至少三次相同剂量的加强免疫效价测定最后一次加强免疫取出脾脏，制备细胞悬液，细胞融合BALB/c02468101214wk试采血加佐剂制成乳剂佐剂:能使抗原缓慢释放，以便延长抗原与免疫系统接触的时间；产生高亲和力的免疫应答64②免疫后取出脾脏65

脾脏为B细胞集中地取出脾脏内细胞（无菌条件下操作。）66③PEG介导细胞融合细胞融合2min加入

PEG67④培养、筛选融合后的细胞均分在96孔板中HAT培养基：这一步筛选，主要是筛选出杂合的瘤细胞。68

融合后的细胞生长状况刚融合完成一个癌细胞与两个脾脏细胞经数次分裂后稳定的细胞群落JuangRH(2003)69PEG脾脏细胞骨髓瘤细胞细胞融合HAT初步筛选杂合细胞ELISA筛选抗体mm11133332m143m12342mmmm3412mm431mmmmmm22244443.4.3单克隆抗体的应用医学检验试剂：主要用于特异性、敏感性要求高的的实验技术中，如传染病的快速诊断；寻找肿瘤特异性抗原及检测肿瘤相关抗原；免疫细胞抗原检测，等等（主要是利用抗原抗体的特异性反应检测特异性抗原）。导向治疗：生物导弹或免疫导弹抗原物质的分离和提纯：亲和层析中作为配体，可筛选特异性抗原物质703.5核移植与克隆动物71一、什么是克隆即由同一个祖先细胞分裂而形成的纯细胞系，这个细胞系每个细胞的基因彼此是相同的。低等的无脊椎动物中－－－常见脊椎动物－－－未见分子水平克隆：PCR技术细胞水平克隆：动物细胞培养（单克隆抗体）个体水平克隆：克隆羊多利什么是克隆技术是一种人工诱导的无性繁殖方式。二、（动物细胞的）核移植74将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到完全复制。将早期胚胎、胎儿或成体动物的细胞核移植到去核的卵母细胞中，重新组成重构胚并使之发育成成体动物的过程。胚胎核移植在多种动物上获得了克隆后代:绵羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),猪(Prather等,1989),山羊(张勇等,1991)等。1997年，由

Mengetal成功地克隆出两只猴,这是灵长类动物的首次被克隆。

1938年汉斯·斯皮曼（克隆之父）蝾螈受精卵的结扎实验

（一）、核移植技术的发展简史HansSpemann分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育？1952年美国费城癌症研究院Briggs和King两栖类囊胚的细胞核移植罗伯特•布里格斯Robert

Briggs

(1911-1983)ThomasKing(1921-2000)1952:Briggs&Kingclonefrogs

1958年到1962年，英国剑桥大学的JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾．1970年JohnGurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核试验，蛙卵发育成了蝌蚪。童第周

上个世纪60年代，童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植。1978年又成功地进行了黑斑蛙的克隆试验，他将黑斑蛙的红细胞的核移入事先除去了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵最后长成能在水中自由游泳的蝌蚪。生物遗传性状是细胞核和细胞质相互作用结果

“童鱼”开创了人类按照需要进行人工培养新物种的先例，对培育动植物新品种具有重大指导的意义。（二）、核移植分类根据核供体细胞来源的不同1.胚胎细胞的核移植2.体细胞的核移植根据供体细胞与受体细胞是否来于同一种动物又可将其分为1.同种核移植2.异种核移植两类。胚胎细胞核移植技术胚胎细胞核移植(embryocelluncleartransplantation)技术。将一个早期胚胎的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建新合子的生物技术，通常将提供细胞核的细胞称为供体，接受细胞核的卵母细胞称为受体。此后，胚胎细胞的核移植在多种动物上获得了克隆后代:绵羊(斯蒂恩·威拉德森等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),猪(Prather等,1989),山羊(张勇等,1991)等。1997年，由

成功地克隆出两只猴,这是灵长类动物的首次被克隆。

哺乳动物体细胞核移植技术动物克隆技术的里程碑里程碑式的突破英国罗斯林（Roslin）研究所维尔穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在《Nature》宣布用乳腺细胞的细胞核成功克隆出一只绵羊“多莉(Dolly)”

。

88维尔穆特等试验的生物学意义是证明了哺乳动物的体细胞也具有全能性。在此之前，人们从未能从哺乳动物的已分化的体细胞再培育出基因相同的个体。但是，他们的试验尚未解决直接从体细胞培养成成体的问题，他们还需借助于卵细胞，即还要依赖卵细胞的细胞质。绵羊“多莉”整个克隆过程如下：母绵羊A乳腺细胞

（体细胞）

母绵羊B未受精的卵细胞

母绵羊C“DollyParton”新的卵细胞发育成胚胎去核卵细胞提取细胞核细胞融合胚胎移植HelloDolly!为什么？卵母细胞核位置靠近第一极体，便于一并吸出。通常用10代以内的培养细胞，为什么？1切开卵母细胞透明带2挤出卵母细胞细胞核3注入供体细胞核4电融合仪融合123455、培养胚胎细胞核移植体细胞核移植细胞核移植的方法

1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此后，体细胞核移植技术在牛、山羊、猪等多种动物获得成功。。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。2000年，杨向中博士领导的实验室在美国从体外培养6-13代的细胞克隆出6头公牛。2000年，美国从衰老细胞克隆出6头小牛。2000年，英国从成年动物体细胞克隆出5头猪。2000年，中国西北农林科技大学从4岁山羊耳上取细胞体外培养，克隆出1头山羊。2001年，体细胞克隆狗诞生。2001年，体细胞克隆兔诞生。2002年，体细胞克隆猫诞生。2003年，体细胞克隆猴诞生。2004年，体细胞克隆大鼠诞生。2005年，体细胞克隆马诞生。962005:我国第一头体细胞克隆猪克隆

小香猪

世界首例体细胞克隆水牛在广西大学诞生

成功率始终很低，具有极大的偶然性和随机性。277个绵羊胚胎——1个多莉；夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大；没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。4存在问题99Dolly的命运：2003年2月14日，多莉因肺部感染无法治愈而死亡，“享年”不足7岁。肺部感染是11-12岁的老年羊的常见病。1999年，法国全国农业研究所的克隆牛犊出生一月后死亡。尸体解剖发现其脾脏、胸腺等组织未正常发育。应用价值及意义检验动物细胞全能性加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物。生殖性克隆克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。可以用患者本人细胞培育出新组织（器官移植）。治疗性克隆1005生殖性克隆101人体细胞克隆技术生殖性克隆（克隆人）治疗性克隆（克隆胚胎）出于医疗目的而在实验室使用克隆技术制造胚胎，然后取出胚胎干细胞进行体外培养以获得再生组织或器官的过程。“生殖性克隆”：指出于生殖的目的使用克隆技术在实验室制造人类胚胎，然后将胚胎置入人类子宫发育成胎儿和婴儿的过程。基于尊重人类尊严的伦理学考虑，目前世界各国政府严禁生殖性克隆。“治疗性克隆”：克隆人类？将普通的体细胞（男性或女性来源均可）和一枚女性卵子结合起来（储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除）。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名供体的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性子宫中，将获得该供体人类的克隆后代。102社会、伦理问题他（她）是正常人吗？该如何看待他（她）？他（她）的父母是谁？谁生育了他（她）？谁爱他（她）？有可能产生真正相同的克隆的孪生子吗？103Whoami？不管克隆技术怎样发展，克隆人怎样产生，都是人，与被克隆人实质上是存在着年龄差的同胞胎。但就是这一点让人们觉得很难应对克隆人出现的伦理关系。这个孩子就是人类的试验品，这位代孕的母体起到的也仅仅是一个生育机或孵化器的作用。英雄、伟人能够克隆吗？身体上任何一部分的细胞是否都可以用来克隆？人可以无休止地被克隆吗？任何克隆动物都有基因上的缺陷。克隆羊和克隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不良、免疫系统缺陷和心肺功能不健全的问题。那么，克隆人呢？104克隆人是否是人类文明的倒退？（有性生殖，无性生殖——克隆）105106

1998年1月，欧洲19个国家在法国巴黎签署了一项有关严格禁止克隆人的协议。这是国际上第一个禁止克隆人的文件。它禁止各签约国的研究机构或个人使用任何技术创造与一个活人或死人基因相似的人，否则将重罚。美国：2001年7月31日，美国国会众议院通过了一项全面禁止克隆人的法案。美国总统布什表示“百分之百”反对克隆人的研究，并已多次敦促参议院通过禁止克隆人的法案。英国：1990年通过的《人类授精和胚胎学法案》，认为克隆人类胚胎的研究是非法的。2001年11月22日英国政府公布一项新法案，明确禁止通过克隆技术复制人类个体，即“繁殖性克隆”，成为世界上第一个立法反对生殖性克隆的国家。德国：1991年德国实行《胚胎保护法》，严格禁止人类胚胎干细胞研究以及克隆胚胎干细胞。2000年11月，德国卫生部提出一项新的《生殖医学法》草案，再次强调在德国不允许进行胚胎干细胞的培育研究。意大利：2001年3月，意大利众议院批准了政府于1998年签署加入欧洲禁止克隆人协议。日本：2000年4月14日，日本内阁会议通过关于《限制对人的克隆技术的法律草案》，禁止克隆人，违者最高将被判处5年徒刑。世界一些国家对克隆人研究的态度：从需要救治的病人身上提取体细胞将该细胞的遗传物质置入一个去除了细胞核的卵细胞该卵细胞开始自行分裂，直至形成一个早期胚胎从这早期胚胎中提取胚胎干细胞胚胎干细胞经过相应的技术处理，便可发展成遗传特征与病人完全吻合的细胞、组织或器官107以前器官移植治疗方法中经常出现的排异反应问题因此得到了彻底解决血细胞、脑细胞、骨骼和内脏等都将可以更换癌症、白血病、帕金森氏症、心脏病等顽疾也有望得到有效的治疗与治愈由于从早期人类胚胎中提取的干细胞拥有形成所有的人体细胞类型的能力，因而它也就有可能成为21世纪最重要、最理想的人体器官替代物的原料。6治疗性克隆治疗性克隆－人兽混合胚胎中国最早进行人兽混合胚胎实验，现已中断/tech/2007-09/27/content_6801227.htm英国批准人兽杂交胚胎研究/article/2007/0907/A20070907814001.shtml108人卵子的来源有限，无法大规模进行。为此科学家们就考虑把人的体细胞移植到去核的动物卵母细胞中，让其发育成为一个混合的异种克隆胚胎进行胚胎干细胞研究，进行“胞质杂交”，获得完全具有人类性状的干细胞胚胎。由此培养出的胚胎干细胞可能帮助找到某些疾病的源头，如与脊髓有关的肌肉萎缩、帕金森氏症或阿尔茨海默氏症等。进行人兽混合胚胎研究的目的主要是用于治疗性克隆研究。通过培育人兽混合胚胎，可以得到大量的干细胞。而干细胞可以分化成人体的各种组织和器官，在器官移植和探寻像帕金森氏症、糖尿病等疾病的病因方面都有着广阔的应用前景。3.6干细胞1093.6.1定义干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。or具有多项分化潜能和自我复制、更新能力的原始未分化细胞，是形成各种组织器官的祖宗细胞。110111来源胚胎干细胞（embryonicstemcells,ESC）：指处于胚胎早期的干细胞。分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力，如囊胚期(受精后5~7天)内细胞团的细胞、原始生殖细胞3.6.2干细胞的分类成体干细胞（adultstemcell，ASC）：具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻)组织器官组成的细胞，如：骨髓、大脑、神经、皮肤、胰腺、角膜、脂肪、心脏、肝脏等组织源干细胞112分化潜能单能/专能/偏能/定向干细胞：只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞(卫星细胞)。全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能。如：受精卵、8个细胞期以前的卵裂球以及胚胎干细胞（后者尚有争议）多能干细胞（pluripotentstemcells）：具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定限制。如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。3.6.3干细胞的生物学特点具有自我更新能力和不同程度的多向分化潜能终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记能无限地分裂、增殖，可连续分裂几代，也可在较长时间内保持静止状态113