第4章 紫外-可见分光光度法

第4章紫外-可见分光光度法第1节光学分析法概论第2节紫外-可见吸收光谱第3节Lambert-Beer定量第4节紫外-可见分光光度计第5节分析条件的选择第6节紫外-可见分光光度法的应用第1节光学分析法概论一、电磁辐射和电磁波谱二、光学分析法及其分类三、光谱法仪器——分光光度计一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量2．电磁辐射的性质：具有波、粒二向性波动性：粒子性：光子的能量与它的频率呈正比，与波长呈反比，而与光的强度无关高能辐射区光学光谱区波谱区3．电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称~。二、光学分析法及其分类（一）光学分析法依据物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称～。（二）分类：

1．光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁波的强度随波长变化的定性、定量分析方法发射光谱例：γ-射线；x-射线；荧光吸收光谱例：原子吸收光谱，分子吸收光谱2．非光谱法：利用物质对电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质建立的分析方法分类：折射法、旋光法、比浊法、χ射线衍射法3．光谱法与非光谱法的区别：光谱法：内部能级发生变化原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变三、光谱法仪器——分光光度计主要特点：五个单元组成光源用于分子吸收光谱用于荧光、原子吸收、Roman光谱单色器作用是将复合光分解成单色光或有一定宽度的谱带吸收池盛放试样的吸收池由光透明的材料制成。分为：紫外光区工作时，采用石英材料可见光区工作时，采用硅酸盐玻璃红外光区工作时，可根据不同的波长范围选用不同材料的晶体制成吸收池的窗口检测器对光子有响应的光检测器对热产生响应的热检测器第2节紫外-可见吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型三、相关的基本概念四、吸收带类型和影响因素一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱，反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，可从波形、波峰的强度、位置及数目看出来，为研究物质的内部结构提供重要的信息。当一个分子吸收了外来辐射之后，它的能量变化为若分子的较高能级与较低能级能量之差等于电磁波的能量2．分子吸收光谱的分类：分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序

3．紫外-可见吸收光谱的产生

由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生（吸收能量=两个跃迁能级之差）二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子→饱和的σ键

π电子不饱和的π键

n电子基态与激发态：电子吸收能量，由基态→激发态成键轨道与反键轨道：能量高低次序

σ<π<n<π*<σ*电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）E很高，λ<150nm（远紫外区）2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（—OH，—NH2）E较大，λ150~250nm（真空紫外区）3.π→π*跃迁：不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）E最小，λ200~400nm（近紫外区）按能量大小：σ→σ*>

n→σ*>

π→π*>

n→π*说明：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁

π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收

电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型

→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ～A作图next2．吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生back3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具有n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁跃迁E较低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—

4．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后

吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）

吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）6．增色效应和减色效应增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应7．强带和弱带：

εmax>105→强带

ε<103→弱带四、吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生C＝O；C＝N；—N＝N—E小，λmax250～400nm，εmax<1002．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—λmax>200nm，εmax>104共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑3．B带：由π→π*跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带

λmax=254nm，宽带，具有精细结构；εmax=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失4．E带：由苯环环形共轭系统的π→π*跃迁产生芳香族化合物的特征吸收带

E1180nmεmax>104

（常观察不到）E2200nmεmax=7000强吸收苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并一起红移（长移）影响吸收带位置的因素：1．溶剂效应：对λmax影响：nextn-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移

π-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↑红移对吸收光谱精细结构影响next

溶剂极性↑，苯环精细结构消失溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<λmax2．pH值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长back蓝移红移back影响吸收带位置的因素：3．共轭效应：共轭体系的形成使体系的最高已占轨道能级升高，最低空轨道能级降低，π-π*跃迁的能量降低。共轭体系越长，能级差越小，最大吸收波长越移向长波方向，吸收强度增大。4．立体化学效应是指因空间位阻、构象、跨环共轭等因素导致吸收光谱的红移或蓝移，并常伴随增色或减色效应。第3节基本原理一、Lamber-Beer定律二、吸光系数和吸收光谱三、偏离Beer定律的因素一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度讨论：

1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）

2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同

3）E↑，物质对光吸收能力↑,定量测定灵敏度↑→定性、定量依据2．吸光系数两种表示法：

1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度

2）百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度

3）两者关系3．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A最大吸收最小吸收特征值→定性依据肩峰末端吸收4．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：2）吸光度读数范围的选择：3）参比溶液(空白溶液)的选择：选A=0.2～0.7注：采用空白消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面（一）光学因素（二）化学因素（一）光学因素

1．非单色光的影响：

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度讨论：入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状结论：选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）选λmax作为测定波长（ΔE↓，S↑且成线性）2．杂散光的影响：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律第3节紫外分光光度计UV-Visspectrophotometer1．光源：2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件分出光波长不等距光栅——衍射和干涉分出光波长等距钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：将光信号转变为电信号的装置5．记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器第5节分析条件的选择一、反应条件的选择显色反应：选用适当的试剂，与待测离子反应生成对紫外或可见光有较大吸收的物质再行测定。选用的试剂叫显色剂。next显色反应的一般要求：反应的生成物必须在紫外、可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大，反应有较高的选择性；反应生成物应组成恒定、稳定性好，显示条件易于控制等，保证测量结果有良好的重现性；对照性好，显色剂与有色配合物的最大吸收差别要在60nm以上。back显示反应条件显色剂的用量溶液酸度的影响显色剂反应时间温度、放置时间二、参比溶液的选择溶剂参比试剂参比试样参比平行操作溶液参比二、干扰及消除方法控制酸度选择适当的掩蔽剂利用生成惰性配合物选择适当的测量波长分离第6节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析二、定量分析一、定性分析（一）定性鉴别

定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较2．对比吸收光谱的特征值（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）2．杂质限量的测定二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法2．标准曲线法3．对照法：外标一点法1.吸光系数法（绝对法）例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？解：2.标准曲线法

芦丁含量测定0.710mg/25mL3.对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100μg/mL）解：1）对照法（二）多组分的定量方法三种情况：1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量2．两组分吸收光谱部分重叠

λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca

海洋上的应用1、分光光度法测定海洋生物样品中的痕量铝2、分光光度法测定海洋河弧菌510脂多糖3、海水和海洋沉积物中总磷的测定4、古糖酯的分光光度法测定5、海洋监测石油标准物质的研制6、应用分光光度法监测大连湾海水COD7、紫外分光光度法测定水中油含量8、紫外分光光度法测定贻贝体内石油烃的方法研究思考题1、分子光谱是如何产生的？2、试说明有机化合物紫外光谱产生的原因。有机化合物紫外