第二章 病毒培养

第二章病毒的培养本动物实验动物鸡胚体外培养的组织细胞第一节实验动物家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠1、分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒2、测定各毒株之间的抗原关系3、制备免疫血清和单克隆抗体4、作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定，建立病毒病动物模型5、培养病毒，制造抗原和疫苗注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。

一、优点

1、组织分化程度低，病毒易于增殖

2、可选择不同的日龄和接种途径

3、感染病毒的组织和液体中含大量病毒

4、容易采集和处理

5、来源充足

6、设备和操作简便易行第二节鸡胚二、缺点

1、胚内可能污染细菌和病毒

沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒

2、母源抗体

3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针三、受精卵的质量和孵化

１、受精卵最好来自SPF鸡群

２、受精卵应该是新鲜的

３、受精卵的壳最好是白色的

４、孵化温度37.5-38.5℃，湿度50-60%，通风。

SPF(无特定病原微生物污染的)四、接种途径

1、绒毛尿囊膜接种

2、尿囊腔接种

3、卵黄囊接种

4、静脉接种蓝舌病毒

5、羊膜腔接种正粘病毒和副粘病毒

6、脑内接种狂犬病毒

7、眼球接种鸡胚的结构与接种途径第三节组织培养

组织块培养

器官培养

细胞培养一、细胞

原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。

继代细胞：将已长成单层的原代细胞从瓶壁上消化下来再作培养获得的细胞。＝《100代传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。无接触抑制现象，而原代细胞有

BHK-21仓鼠肾细胞、PK-15、IBRS-2、MDBK牛肾、MDCK、Hela、Vero非洲绿猴肾细胞、TK-143、Marc-145、Sf9昆虫

细胞瓶：800ml(100~150ml)100ml(10ml)50ml(6~8ml)优点：

1)可以无限的传代。

2)不少细胞系对病毒很敏感。

3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。

4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。绿荧光蛋白在IBRS-2细胞中的表达40X100XA正常IBRS-2B消化的IBRS-2BAAA正常PK-15B消化的PK-15C感染PRV的PK-15CB接种PRV后不同时间的PK-15BA二、细胞培养所用器材

1、玻璃器皿

2、塑料制品

3、橡皮制品

4、滤器

蔡氏滤器、玻璃滤器、微孔滤膜三、洗液和溶液

1、Hanks液（NaCl、KCl、MgSO4、MgCl2、CaCl2、Na2HPO4、KH2PO4）

使用前用NaHCO3调pH值。

2、Earle液（NaCl、KCl、MgCl2、NaH2PO4）

使用前用NaHCO3调pH值。

3、磷酸盐缓冲溶液（PBS）（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、MgCl2、CaCl2）4、组织培养常用抗生素液抗生素抗菌谱参考浓度（μg/ml）细菌真菌支原体青霉素-GG+100IU/ml链霉素G-100庆大霉素G+/G-+200四环素G+/G-+10卡那霉素G+/G-+50两性霉素B+2制霉菌素+255、pH调整液

NaHCO3溶液（7.4%、5.6%、3.7%）

Herpes溶液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）

6、谷氨酰胺7、细胞分散剂（消化液）

能使组织块或成片细胞分散成单个细胞。

１）胰蛋白酶溶液（trypsinsolution）

作用机制：使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

其活力用解离酪蛋白的能力来表示，常见的有1:125和1:250两种。

使用浓度：0.25%、0.125%、0.08%

最佳作用条件：pH8.0、37℃２）乙二胺四乙酸二钠（EDTA）(Versene液）

作用机制：与钙、镁离子结合

使用浓度：0.02%

使用方法：单独作用或与胰酶按一定比例混合作用

３）灰色链丝菌酶

蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶四、培养液（基）

（一）天然培养基

动物血清、水解乳蛋白以及自制的体液或组织提取液1、血清（serum）

1）血清的种类和来源

胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)

新生牛血清(newborncalfserum,NCS)

成年牛血清(adultbovineserum)

马血清(horseserum)

鸡血清(chickenserum)

兔血清(rabbitserum)

羊血清(sheeporgoatserum)

人血清(humanserum)2）血清的作用

A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。（胰岛素、生长激素、表皮生长因子、神经生长因子）

B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。（低分子量营养因子）

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。D、提供载体蛋白（转铁蛋白、无脂肪酸白蛋白），可结合维生素、脂质、金属离子等。

E、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。

F、给培养液提供良好的缓冲系统。

G、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。3）应用血清存在的问题

A、存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子等。

B、成分不明确，影响对结果的分析。

C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。4）采血后血清的分离

采血后将采血瓶或管倾斜，于室温放置2~4h，等血液充分凝结后，移入4℃冰箱过夜，让血清析出，次日吸取析出的血清，以4000r/min离心10min，收集血清。5）血清的质量要求

A、无细菌、无支原体、无病毒和内毒素

B、肉眼观察外观呈淡黄色、澄清透明、较少溶血、无杂质

6）血清使用前的处理

A、过滤除菌

B、灭活（56℃30min）

C、针对所培养的细胞进行促细胞生长效应的测定

2、水解乳蛋白

为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，可用于许多细胞系和原代细胞的培养。

3、胚胎浸出液

鸡胚浸出液

牛胚浸出液

主要成分为大分子蛋白和小分子氨基酸。（二）合成培养基

1、种类：E-MEM（Eagle氏最低要素营养液）

RPMI-1640

DMEM

199

L-15

主要成份：氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子

氨基酸：精、组、亮、异亮、蛋、赖、苯丙、苏、色、酪、缬、谷氨酸和谷氨酰胺2、合成培养基的配制：

A、取清洗干净的大烧杯1个，加入新鲜制备的三蒸水，加热至15~30℃。

B、加1袋培养基干粉入水中，并用少量三蒸水涮洗装培养基的袋，涮洗的水倒入大烧杯中，搅拌使粉剂溶解。

C、按说明书，加入所需量的NaHCO3以及其它可能需添加的成分。D、加水至终量。

E、测定培养液的pH值，并用1mol/LHCl或1mol/LNaOH调节pH值，一般调至pH7.0~7.2。

F、用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

G、标记培养液名称和配制时间，置4℃冰箱贮存。生长液：含10%犊牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的培养液

维持液：含2-5%犊牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的培养液（三）无血清培养基

优点：

A、成分确定

B、可以排除血清中许多未知因素的干扰。缺点：

A、成本高。

B、针对性很强，一种无血清培养基仅适用于某一类细胞的培养五、细胞培养

（一）细胞培养的条件要求

1、细胞密度

原代细胞：4~6×105个/ml

传代细胞：2~3×105个/ml

2、pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3、培养温度（二）细胞培养的方法

1、单层细胞培养

2、悬浮细胞培养

3、微载体细胞培养（三）原代细胞培养

基本步骤：

切取要培养的动物器官或大组织块

洗去血污

剔除多余成分

将所取组织剪碎

蛋白酶溶液消化机械方法吹打组织块

不锈钢网筛过滤

对滤过液离心

用培养液悬浮成细胞悬液

计数并调节密度

用于分离细胞培养鸡胚成纤维细胞：

１）在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼）、爪和内脏，并剪成块。

２）用Hanks液充分冲洗后移入平皿中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。３）剪碎后移入大号青霉素瓶或其它容器中，加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。如此反复冲洗2-3遍。

４）于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30min，每10min轻轻摇动一次。５）取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用洗液轻洗2次后，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。

６）用双层或3层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以2000r/min离心沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。７）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml）

按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。

每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。血细胞计数板○表示可计数●表示不计数

体外细胞的染色检测方法：

原理：死活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。

常用染料：中性红（活细胞着色，死细胞不着色）

结晶紫（死细胞着色，活细胞不着色）

台盼蓝（死细胞着色，活细胞不着色）台盼蓝排除检测法：

2%台盼蓝溶液的配制：称取2g台盼蓝，加少量双蒸水研磨粉碎后，再加水至50ml，离心后取上清液，再加入1.8%NaCl溶液至100ml。

活体染色与细胞计数：

将1滴细胞悬液与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。

2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比（活细胞应在95%以上）。

8）分装于细胞瓶中，置温箱中培养。（四）传代细胞系培养

1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。

2）加入1~2ml胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。3）加入生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1~2天即可长成单层。（五）细胞培养物的常温短期保存

1、实验室中细胞短期保存。

①

将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22℃下避光保存，可达15天以上。

②

将细胞培养温度由37℃降至32℃甚至30℃，可隔15-30天传代一次。2、长途运送细胞培养物的保存。

取刚长成单层的细胞培养物，弃去营养液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右，到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。（六）细胞培养物的冻存与复苏

1、培养物的冻存与复苏原理

冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。

复苏(thawing)：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。原理：在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。采取适当的方法将生物材料降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。细胞内冰晶的损伤(intracellularicedamage)：因细胞内部结冰而致的细胞损伤。

溶质损伤(solutedamage)：也称为溶液损伤(solutiondamage)，由于保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤。1）冷冻保护剂

渗透性保护剂：甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇

非渗透性保护剂：聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、羟乙基淀粉

作用机制：减少冰晶损伤和溶质损伤。2）冷冻速率

细胞在冻存过程中的生理变化：当细胞被冷至-5℃左右时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低了溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5℃~-15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。结果，细胞内水分为了和细胞外水分保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度慢：细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰。

冷冻速度快：细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰。

冷冻速度非常快（即超快速冷冻）：细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。不同细胞的最适冷冻速率不同:

1.6℃~3000℃/min

小鼠骨髓干细胞1.6℃/min

酵母7℃/min

人红细胞200℃/min

3）冷冻保存温度

-196℃可保存10年以上

-70℃可保存1个月左右

在冰点至-40℃范围内保存细胞效果不好

4）复温速率

在37℃水浴中，于1~min内完成复温2、冷冻保存方法

按冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶分为：

非玻璃化冻存有冰晶形成

玻璃化冻存无冰晶形成非玻璃化冻存方法

1）待冻存细胞悬液的准备

A、按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备成单细胞悬液。计算细胞总数。

B、将细胞悬液800~1000r/min离心5min，弃上清液。C、向沉淀物中加入冷冻液（含10%DMSO、20%小牛血清的细胞培养液，或含10%DMSO的小牛血清）。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达到1×106~1×107个/ml。

D、按每管1~1.5ml的量，分装于冻存管内。拧紧管盖。

E、在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期，冻存人。2）分级冷冻的方法

第一种方法：

A、先将冻存小管放入普通冰箱下层（4~8℃），约40min~2h。

B、置于普通冰箱上层冰盒（-10~-20℃），30min~2h。

C、再于-30℃放置30min左右。

D、然后在-70~-80℃下过夜。

E、最后将冻存小管投入液氮保存。第二种方法：

将冻存小管放入电子计算机程控降温仪内，并根据不同的细胞以不同的降温速度连续降至-100℃以下，再投入液氮保存。

第三种方法：

将冻存小管先悬挂在液氮罐口20min，再直接投入液氮中保存。第四种方法：

用4℃预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒内封好，再将小盒放置在-70~-80℃冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。第五种方法：

将冻细胞管置于液氮气相中，按5min1cm的速度逐渐往下降，直至液氮中长期保存。

3）记录

日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置、冻存人。4）注意事项

A、DMSO对人体有毒，使用时不需要高温。

B、小心液氮冻伤皮肤。

C、冻存前要确保细胞具有高活力、无微生物污染。

D、在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1~2管，以观察其活力以及是否受到微生物污染。

E、冻存管最好采用塑料管。3、冻存细胞的复苏

（非玻璃化冻存细胞的复苏方法）

1）复苏过程

第一种方法：

A、调配37~40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调至37~40℃。

B、从液氮中取出冻存小管，立即投入37~40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。最好在1~2min内完成复温。C、将细胞冻存悬液移入离心管中，加入约5ml培养液，轻轻吹匀。

D、将细胞悬液经800~1000r/min离心5min，弃上清液。

E、加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞转入培养瓶内，加足生长液进行培养。

第二种方法：

A、B同前

C、将融解的细胞培养物直接转移到细胞培养瓶中，补足生长液，置温箱中培养，贴壁几小时后，再换入新的生长液继续培养。（七）培养物的污染

1、微生物污染的判断

判断微生物污染的方法：目测、显微镜观察、电镜检查、特殊染色鉴定、微生物培养试验、免疫学和分子生物学检测

1）细菌的污染及其判断

培养液混浊、呈现黄绿色、显微镜下可见到点状或杆状的细菌2）真菌的污染及其判断

酵母菌污染：培养液混浊、呈现黄绿色、显微镜下可见到圆形或卵圆形的酵母菌。

霉菌污染：显微镜下可见到呈丝状或树枝状生长的菌丝。肉眼可见有白色如棉絮状的丝状团块漂浮在培养液中。3）支原体的污染及其判断

在显微镜下无特殊的外观表现，培养基也不混浊。

初步判断支原体污染的依据：显微镜下发现破碎的细胞较多，需频繁改善营养环境才能支持长期传代培养。

检测方法：DNA荧光染色、PCR、免疫学方法、支原体培养法A、未受微生物污染B、受细菌污染C、受酵母污染D、受霉菌污染4）病毒的污染及其判断

A、引起细胞病变的病毒的污染

可直接通过显微镜观察

B、不引起细胞病变的病毒的污染

电子显微镜观察、PCR、免疫学方法2、污染的预防

1）培养操作前的准备

A、定期清洗或更换超净台的空气滤网，检查超净台的空气净化标准

B、检查培养器皿是否有消毒标志

C、检查培养液是否无菌

D、操作前提前半小时启动超净台及其紫外灯

E、操作者应先洗手2）培养操作时的注意事项

A、在超净工作台面放置的所有培养瓶瓶口不能与超净工作台的风向相逆。

B、不允许用手触及器皿的无菌部分。

C、在安装吸管、开启或封闭瓶口操作时要经过火焰烧灼，并在火焰附近进行。

D、吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。E、使用培养液前，不宜过早开瓶，不再使用的培养液应立即封闭瓶口。

F、培养的细胞在处理之前勿过早暴露于空气中

G、操作时不要交谈、咳嗽。

H、操作完毕后应整理好工作台，用消毒剂抹式工作面，关闭超净工作台。3、污染的排除

1）抗生素的应用

2）巨噬细胞共培养的方法

A、在良好的体外培养条件下，巨噬细胞可存活7-10d。

B、分泌一些细胞生长因子支持其它细胞的克隆生长。

C、吞噬微生物并将其消化。

3）小鼠皮下/腹腔过继培养法

主要用于肿瘤细胞和杂交细胞中污染的细菌与支原体的清除。六、病毒在细胞中的培养

1、病毒（PPV除外）在细胞中培养的方法

1）选长满单层的细胞，倒掉培养液。

2）加入适量的病毒悬液

3）置温箱中感作（吸附）45min~1h。

4）取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒悬液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至细