遗传与发育综合实验实验讲义

遗传与发育

综合实验

讲义

第一部分：分子标记技术系列实验：实验一RAPD标记

实验内容：1DNA制备

2PCR扩增3

RAPD结果检测统计分析

实验二SSR标记实验内容：1基因组DNA制备2微卫星DNA的扩增

3

SSR标记检测分析

实验三AFLP标记实验内容：1酶切与连接

2选择性扩增3银染

4目的DNA的回收第二部分植物基因克隆技术系列实验实验一利用RT-PCR技术分离目标cDNA片段实验内容：1cDNA合成

2PCR扩增3筛选目标cDNA实验二mRNA差别显示技术实验内容：1

RNA制备

2逆转录3PCR差异显示mRNA

4.测序胶分离PCR产物

5.银染6.结果与讨论第一部分

分子标记技术系列实验遗传标记在遗传学的建立和发展中有着举足轻重的作用，同时也是作物遗传育种的重要工具。遗传标记主要分为:形态标记、细胞学标记、生化标记分子标记。分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至是细胞作检测，既不受环境的影响，也不受基因表达与否的限制；数量丰富；遗传稳定；操作简便等特点。广泛应用。

DNA分子标记使得基因组作图工作成了遗传学上描述细胞中所含遗传物质的一个简单概念，已形成了一门复杂的新兴学科—基因组学，其影响之大不仅波及了生物学、医学和农业的各个方面，而且对社会也产生了巨大的冲击。

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，其发音与英文字母“rapid”相同）技术是由美国杜邦公司的Williams和加里福尼亚生物研究所的Welsh于1990年同时发展起来的。核心技术都是通过PCR进行DNA扩增。

第一单元：RAPD标记RAPD的基本原理：通过DNA扩增片段的多态性来检测DNA所发生的遗传变异。RAPD以检测DNA的多态性为目的，但它检查的不是限制性内切酶片段的多态性，而是PCR扩增DNA片段的多态性，这种多态性反映了不同个体模板DNA的核苷酸变化。多态性产生的原因：一，模板中引物结合区的核苷酸变化导致扩增DNA片段多态性。

二，扩增范围内的碱基插入、缺失、DNA重排等核苷酸变化导致扩增DNA片段多态性。

1）取50-200mg新鲜叶片，置液氮中研磨成粉。2）将冻粉分配到两个1.5或2.0ml的离心管中,加入提取缓冲液900μl,轻轻搅动,。3）各加入100μlSDS，于65℃水浴中保温10-15min(间隔晃动2-3次)。实验操作:1.DNA制备4）各加入160μl5mol/LKAc,充分混匀，冰浴中放置30min。5）

4℃下12000rpm离心15min。6）上清转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻。7）4℃下8000rpm离心10min。8）上清转入另一离心管中，加入2/3倍体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，放置30min,观察DNA沉淀生成。9）

4℃下8000rpm离心10min，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液。10）用80%的乙醇洗涤沉淀，吹干10-15min。11）加入100μlTE缓冲液充分溶解沉淀（若溶解不好，可置37℃水浴中保温，促进溶解）。12）加入2μlRNase酶液，于37℃保温1h。13）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后10000rpm5min,重复一次。14）转移并量出上清液体积，置新离心管中，加入1/5倍体积的3mol/LNaAC,混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，室温放置数分钟。15）10000rpm离心5-10min，按9）操作，去尽上清液。16）用80%乙醇洗涤沉淀2-3次，吹干。加入10μlTE或dH2O溶解DNA，备用。1)在冰上做好针对不同DNA的100个PCR反应混合液（加样次序如下）：水1475μl10×缓冲液200μl10×dNTPS200μl引物(20μmol/L)20μlTag聚合酶5

μl终体积1900μl(分装100管)DNA（10-100ng）每管1μl2．

PCR扩增：2)将反应混合液等量分装到反应管中。3)加入DNA或引物4)盖上小管，放到PCR仪上。5)进行PCR反应，采用3步PCR程序：a)1个循环94℃4min36℃1min72℃1.5minb)45个循环94℃1min36℃1min72℃1.5minc)72℃5min4℃保存3．RAPD结果检测：1）用1×TBE配2%琼脂糖凝胶。2）PCR结束后，每个样品中加入4μl凝胶上样缓冲液。每个泳道上样20μl，选择合适的相对分子质量Maker（如λHindIII/EcoRI）。3）

电泳。4）

观察。第三单元：SSR标记在人类及动植物的基因组中,包括内含子、编码区及染色体上的任一区域,均存在着由1～6个碱基对组成的简单重复序列(simplesequencerepeats),简称SSR,又称之为微卫星DNA(microsatellteDNA).研究表明,在真核生物中大约每隔10～50ｋｂ就存在1个微卫星,其主要以2个核苷酸为重复单位,也有一些微卫星重复单位为3个核苷酸,极少数为4个核苷酸或更多.

SSR较早应用于人类和哺乳动物的研究,既可以作探针进行Southern分析,又可以根据其序列设计引物进行PCR检测,是构建遗传连锁图谱非常有效的分子标记。

另外,SSR标记在物种的起源和进化、遗传多样性、遗传疾病的诊断、基因表达等遗传和育种有关的研究领域中有着广阔的应用前景.SSR标记因具有:①随机分布在整个基因组中;②多态性高;③可通过ＰＣＲ迅速测定,重复性好;④技术难度低,实验成本较低;⑤引物序列公开发表,易在各实验室中广为传播使用等特点。1．基因组DNA制备（略）。

注意：进行SSR分析时,要制备高分子量(HMW)的基因组DNA。SSR标记虽然对DNA的质量要求不是特别高,但要通过加入蛋白酶和RNA酶消化去除其中的蛋白质和RNA,同时严格避免不同DNA之间的交叉污染.提取DNA后,测定浓度,并稀释到10×10-9～20×10-9ｇ/μＬ(10～20ｎｇ/μＬ),-20℃贮存备用。2．微卫星DNA的扩增：反应总体积为25μL

包括：10mmol/ＬTrisHClpH8.3,30mmol/LMg2+25mmol/LdNTP

0.4～10ｕDNA聚合酶2μmol/ＬSSR引物约100ｎｇ基因组DNAPCR扩增程序：94℃5min94℃30ｓ退火温度30ｓ30cycle72℃1min72℃5min3．SSR标记电泳检测：分3个主要环节。1）电泳：

采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,设恒定功率,预电泳约30min后,加扩增样品DNA4～6μL,电泳40～60min(视ＳＳＲ分子量大小及差异带的可辨度调整电泳时间)。

2）染色：SSRPCR扩增产物电泳之后用银染法来检测扩增产物,不仅可避免使用同位素,而且分辨率很高,甚至能检测出1ng以下的DNA。3）统计分析：观察带的有(计为1)或无(计为0)及相对位置,然后根据不同的研究目的,应用相关软件进行分析。第三单元：AFLP标记AFLP（扩增片断长度多态性

amplifiedfragmentlengmentpolymorphism）是一种十分有效的DNA指纹图谱技术。1993年由Zabean和Vos提出完善。

AFLP不仅是RFLP和PCR相结合的一种技术，而且完善了RFLP和RAPD两种方法的特长。

基本原理：对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增，使用双链人工接头与该酶切片段相连接作为扩增反应的模板，在DNA聚合酶作用下进行PCR反应。该技术的独特之处在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接头以及可与接头序列配对的专用引物，因此在不需要事先知道DNA系列信息的前提下，就可对酶切片段性传统的PCR扩增。

在检测AFLP时，先用内切酶酶解基因组DNA,再将接头连接到限制性片段的两端，然后用专用引物扩增连接后的限制性片段的混合物，扩增结果通过电泳显示。

一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶的切点较少，因而AFLP反应过程中产生的主要是两个酶共同酶切的片段。此外，设计的专用引物除了核心碱基系列和限制性内切酶识别序列外，引物的3’段引伸出1-13个数量不等的随机核苷酸碱基，通过运用不同数量的这种碱基，可以调节AFLP产物的条带特异性和数量，从而提供较多的基因组多态性信息。

不同样品由于DNA序列不同，扩增出片段数及长度各不相同，经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳就能区分出不同样品的带之间的差异，作为遗传标记构建连锁图，或由于其独到的检测DNA多态性的方式，已成为基因组研究的一个非常有用的工具，与RFLP相比，它无需了解DNA模板序列，产生的多态性较多，与RAPD相比，它的可重复性得到极大提高。

AFLP技术的应用：从AFLP技术建立以来，在植物研究领域已被应用于许多方面，如：生物多样子性分析、建立基因图谱、得当与农业性状对应的标志、用于基因克隆等。作为分子标记技术应有以下要求：稳定性好、分辨率高、多态性强、效率高。另外，AFLP的标志还可以进一步用于系谱分类，通过各样品共有标志的多少，可以分出它们之间的远近。

AFLP最大的特点是能产生大量的DNA标志，建立基因图谱，通过对它的分析，人们可以了接导基因结构特点。到目前为止，已有几十种植物得到了大量DNA标志。包括：向日葵、棉花、油松、胡椒、小麦、大麦、马铃薯、水稻、兰花、橡树、番茄、甜菜等。

本实验应用AFLP技术对特异物种的基因组DNA进行分析，找出差异DNA条带并作进一步分析。

实验操作酶切与连接模板(50ng/ul)4ul接头1ulEcolⅠ（4u/ul）1ulMseⅠ（4u/ul1ulT4DNAligase(3u/ul)1ul2×PCRbuffer2ulATP2ul(10mM)H2O8ul离心，混匀。程序：30℃，4小时。8℃过夜。在PCR仪中运行。预扩增模板2ul引物2×0.2uldNTP0.5ul10×PCRbuffer2.5ulTaq酶(2u/ul)0.5ulH2O19.1ul离心，混匀。程序：94℃2min94℃40s56℃30s30Cycle72℃80s72℃5min选择性扩增

预扩增产物按1：20稀释。稀释后的样品作为选择性扩增的模板。模板2ul

引物(EcolⅠ和MseⅠ的引物各一种)2×0.2uldNTP1ul10×PCRbuffer5ulTaq酶(2u/ul)2ulH2O39.6ul

离心，混匀。程序：

94℃2min94℃30s65℃30s72℃80stouchdown每轮0.7℃，共12轮。94℃30s55℃30s

72℃80s扩增23轮。银染样品的准备：选择性扩增的产物与甲酰胺上样缓冲液（98%甲酰胺，10mMEDTA,0.25%溴酚兰）2：1混匀，95℃变性8分钟，立即冰浴，待用。6%变性胶的制备、电泳1、6%Arc/Bis胶贮液尿素420.42gArc60g定容到1L，过滤。

Bis3.16g4℃保存。10×TBE50ml2、胶的制备6%Arc/Bis50ml10%AP250ul10×TBE50ul3、玻璃板的消化及组装洗净的玻璃板淋干，用95%的酒精冲洗2遍，干燥。用吹风机预热玻璃板。分别向两板上用擦镜纸涂300ml剥离硅烷。通风厨中干燥30分钟。组装。灌胶。4、预电泳向上槽液中加入0.5×TBE，下槽液中加入1×TBE，300V电泳半小时。5、上样、电泳吹净加样孔中的尿素和气泡。上样。250V电泳4小时。银染1、固定：10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定6分钟，分两次进行，可过夜2、染色：0.2%硝酸银溶液中浸泡20分钟，时间可稍长。3、漂洗：蒸馏水充分漂洗。2-3遍。4、显色：1.5%氢氧化钠和0.4%甲醛显色。预冷。10℃最好。5、终止：0.75%碳酸氢钠溶液。6、胶可在固定液中保存几天。7、也可制备干胶。制备前，将胶和剥离纸在5%的甘油溶液中浸泡3小时。目的DNA的回收用刀片切取差异条带，置于Ep管中。加入100ul双蒸水，室温静置10分钟。煮沸15分钟。高速离心2分钟。弃沉淀，留上清。向上清中加入10ul,3mol/l,PH5.2,NaAc;5ul,10mg/ml糖原；400ul,100%乙醇。混匀。-70℃放置30分钟，或者-20℃更长时间。4℃高速离心10分钟。弃上清。加入500ul，85%乙醇洗沉淀。干燥，溶于10ul双蒸水。取4ul进行PCR反应，其余-20℃保存。第二部分植物基因克隆技术系列实验第一单元：用差异显示法分离特异表达的基因片段

差式显示（Differentialdisplay）是由Liang和Pardee在1922年建立的一种新的分子生物学技术，其目的就是对不同细胞的mRNA进行比较，寻找特异表达的基因。由于该方法简便直观，目前在动物、植物中已有很多成功应用。

差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增mRNA中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6%~8%polyacrylamidegel）同步分离显示扩增产物以进行比较。首先，要以5’-T(n)MN-3’(3’固定引物，3’anchoredprimer，其中n=10~20,M=dA/dC/dG,N=dA/dC/dT/dG)作引物，将待比较的mRNA进行逆转录得到单链cDNA为模板,由于该引物具有poly(dT),故可与mRNA的3’-poly(A)结合，而另外两个碱基MN的作用是使它定位在poly(A)的5’端，并使它只介导约1/12的mRNA的逆转录（为什么？）。

逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR,3’端就是上述3’固定引物，5’端引物是10~13个碱基的随机引物（5’arbitraryprimer）。对于在细胞A中表达而不在细胞B中表达的基因来说，若引物合适，就可能在A的PCR产物中发现相应的基因片段，而不会在细胞B的PCR产物中发现该片段。由于5’端引物较短，特异性较低，能以相对较高的机率与cDNA5’端结合，从而保证每一对引物都能扩增出适当数量的DNA片段（约50~150条）。若片段数过少，要对全部mRNA进行比较就必须合成大量引物，进行大量PCR；若片段数过多，又会增加分离纯化的难度，当每次PCR扩增50~150个片段时，通过对12个3’引物和25个5’引物的不同组合，可以在95%的情况下分析15000个不同的基因，基本包括单个细胞所能表达的全部基因数。

由于PCR的产物一般含有几十至上百个分子量相近的DNA片段，所以需要用高分辨率的测序胶（6%~8%的聚丙烯酰胺凝胶）来分离这些片段。

PCR产物分离后的显色，本实验采用银染法。

显色后我们会看到很多条带，其中大多数是共有的，但在某些位置上会有特异的条带，这些条带就是我们要找的特异表达的基因片段。

银染法的原理是利用了DNA对银离子的吸附作用，将吸附的银离子还原成金属银，从而显示DNA条带的位置。其优点是灵敏度高，显色快速简单，可在电泳后几十分钟内得到结果。使用放射性同位素虽可达到近似的灵敏度，但一般需曝光几十小时以上，并且要求PCR中掺入同位素，因此对防护的要求较高，使操作复杂化。

银染法的缺点是必须将DNA固定在胶上才能有好的染色效果，这就使得从胶上回收特异的DNA片段进行后续实验十分困难，所以在实际操作中并不使用。

操作步骤1．

RNA制备1)液氮研磨，材料剪碎直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。2）室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。3）12,000rpm离心5min，弃沉淀。4）按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。5）4℃12,000g离心15min。6）吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面。7）按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。8）4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。9）按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。10）4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。11）室温晾干或真空干燥5-10min。

注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。12）可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。

注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。2．逆转录：1）按下列方法建立四套不同的简并oligo(dT)锚定引物（T7T12MG,T7T12MA,T7T12MC,T7T12MT）5×RTbuffer4ul

dNTP1(1mM):1ul

总RNA:0.2ug(或mRNA0.1ug)

T7T12MN:1ul

加水补足：19ul

离心数秒混匀。2）65℃温育2min，37℃温育5min；3）加入1ulM-MLV(RNaseH-)反转录酶，离心数秒，37℃50min；4）95℃温育5min灭活反转录酶，稍加高速离心以收集液滴，可立即用于PCR扩增，或贮存于-20℃，用于下面实验。3PCR差异显示mRNA：1）对于每一套引物按以下方案准备20ul反应液：10×PCRbuffer:2uldNTP2(0.2mM):1ulT7T12MN:1ulM13十聚体随机引物：1ulcDNA(RT产物)：2ulTaq-plus:0.5-1ul加水补足：20ul2）离心数秒，按下列参数进行PCR扩增：94℃预变性2min94℃变性30秒40℃复性20秒40循环72℃延伸60秒72℃延伸加时10min4.测序胶分离PCR产物配胶：5.7g丙烯酰胺，0.3gN,N’-甲叉双丙烯酰胺,48克尿素，放入200mL烧杯中，加入20mL5×TBE,20mL重蒸水，搅拌溶解，由于尿素溶解时吸热，故可将烧杯置于37℃水浴促溶。待完全溶解后，定容至100mL，Wattman3MM滤纸过滤，然后于4℃避光保存备用。另外配置10%过硫酸铵溶液0.5mL，注意一定要现用现配。胶板的准备：将两块玻璃板洗净，蒸馏水冲洗一遍，晾干。用脱脂棉蘸2~3mL疏水硅化液在长方形玻璃板上均匀涂抹至干，用装无水乙醇的洗瓶自上至下冲洗一遍，冲掉未结合上的硅化液，晾干备用。在凹形玻璃板上用亲水硅化液5mL同法进行亲水硅化。灌胶：在两块玻璃板之间两侧各夹上一个0.4mm厚与胶板等长的塑料间隔片（spacer），用胶布将三面封死，用铁夹夹紧。在100mL配好的聚丙烯酰胺凝胶贮液中加入0.5mL10%过硫酸铵，轻摇混匀，再加入50μLTEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），轻摇混匀，注意不起气泡。然后将立起胶板，稍倾斜，将配好的胶沿玻璃板慢慢倒入胶板间的空隙，注意不要再胶中留着气泡。若已产生气泡，可将胶板适当倾斜以使胶面降至气泡以下，气泡会自然破裂。倒满胶厚，水平放置胶板，将梳子的平面插入两板之间约4~5mm，用铁夹固定，静置1h左右使胶聚合完全。上样：胶凝厚，撕去胶布，轻轻拨出，注意不要损坏胶面。用注射器水冲洗胶面，洗掉碎胶。反转梳子，将锯齿面插入两板之间，使齿尖稍进入胶面（约0.5mm），数字齿之间的间隙即是样品槽。把胶板固定在电泳槽上，槽中加入1×TBE至没过胶面。用1900V预电泳20min，同时将样品于80~100℃加热变性2min后立即置于冰上，使其保持单链状态。停止预电泳，用注射器灌电泳液将胶面上析出的尿素冲掉，即可开始上样。上样使用微量进样器，每个样品取10μ左右。

注意，每一对样品必须相邻并且同时电泳。电泳：上完样后，立即开始电泳。电压设为1900V左右。电泳时注意不要使胶的温度太高，必要时可将铁板夹在玻璃板上帮助散热。电泳至第二道染料（二甲苯菁FF）即将出胶时停止（一般需2~4h）。放掉电泳液，取下胶板，将两块板轻轻撬开，胶将会留在亲水硅化过的板上。5.银染拿胶板时应戴手套，拿胶板的边缘，以防止指纹。固定：胶面向上将胶板放入一个浅塑料盘中，倒入固定液，使其没过胶面。轻轻摇晃20min左右至看不见胶上的染料时，将板取出。注意回收固定液。洗胶：用重蒸水浸泡胶板2min，取出后沥干10~20s，换水浸泡。重复三次。染色：将板转入染色液，轻摇30min。显色（注意要严格控制各步的时间）：a：将3mL甲醛及400μL硫代硫酸钠（10mg/mL）溶液加入10~20℃的显色液中。b：从染色液中取出胶板，重蒸水中浸泡5~10s，立即取出（若超出时间，须重复染色步骤）。c：将胶板置于1L预冷的显色液中，充分振荡，直至看见第一个条带，然后将胶板转至另1L显色液中，继续显色2~3min，至其余条带清晰可见。终止显色：将回收的等体积固定液直接倒入显色液中，摇2~3min终止显色。清洗：用重蒸水浸泡两次，每次2min。干燥：将胶板置于室温晾干。然后，在浅色背景下即可进行观察。结果与讨论1.PCR是一种高度灵敏的DNA扩增反应，它可把单个DNA分子扩增105倍以上。反应体系中微量的DNA污染都可能对结果产生很大的影响，因此在配制PCR反应混合物时应非常小心，所用的tip头应是灭菌的新tip头，每加一种试剂应换一个头。模板DNA应最后加，以尽可能减少污染的几率。由于本实验要对两组cDNA进行比较，所以二者的反应条件应尽可能相同，以免引入虚假的差别。为达到此