发酵工程硕士论文

发酵工程硕士论文申请学位学科专业：发酵工程摘要谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物，具有去除自由基、解毒、抑制衰老、预防糖尿病和癌症、抑制艾滋病毒、提高人体免疫力等重要生理功能，在医学、食品、化装品等领域具有广泛的市场前景。现有GSH生产能力远不能满足市场需求，所以采用GSH高产菌株发酵廉价原料转化为GSH，建立适合工业化别离纯化GSH的方法会带来巨大的社会和经济效益。本文以富含GSH的啤酒酵母Y-14为材料，分别从以下四个方面进行研究：(1)利用Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken试验设计法对啤酒酵母Y-14产GSH培养基进行优化，得到的最适培养基配方为:葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15g/L。对优化结果进行验证(2)利用单因素试验对啤酒酵母Y-14产GSH发酵条件进行研究，结果得到摇瓶最适发酵条件为培养温度30℃、初始pH6.0、摇床转速180rpm、摇瓶装液量30mL/300mL、补料培养基添加时间20h。在此条件下，菌体胞内GSH含量到达31.56mg/g，GSH的产量可达249.2mg/L，较原来提高了102%。(3)利用10L自动发酵罐补料培养啤酒酵母Y-14，①采用恒速流加单一葡萄糖培养基，20h时添加前体氨基酸和ATP的方法，测得GSH的产量在52h时，到达最大值243mg/L。②采用恒速流加全营养培养基，36h时添加补料培养基的方法，测得GSH产量在52h到达最大值520.742mg/L。比拟发现，第二批发酵罐培养菌体干重、GSH产量较第一批分别提高了122.5%、114.2%。(4)采用D001大孔树脂粗别离GSH，得到最正确别离条件为：上样pH3.0，浓度为61.4mg/100mL，流速为0.5mL/min，洗杂质用液为无水乙醇，洗脱液为1.5%HCl+0.3mol/LNaCl，流速为3mL/min。GSH的平均收得率为69.11%，蛋白质去除率为64.8%。然后通过SephadexG-10脱盐纯化GSH，得到最适条件：Φ1.6cm×25cm玻璃层析柱，上样浓度为116.66mg/100mL，上样体积为20mL。结果GSH的平均收得率为96.21%。最后SephadexG-10分级别离纯化GSH，采用Φ1.6cm×50cm玻璃层析柱，最适上样体积为2mL，GSH的平均收得率为99.26%，蛋白质去除率为56.5%。GSH浓缩倍数平均为9.07倍，纯化倍数为8.67倍。关键词：啤酒酵母Y-14，谷胱甘肽，发酵罐，D001大孔树脂，SephadexG-10

AbstractGlutathione(GSH)isatripeptideformedbyglutamicacid,cysteineandglycin,ithasimportantphysiologicalfunctionssuchasremovingfreeradical,detoxification,anti-aging,diabetesandcancerprevention,inhibitionofHIVandimprovetheeffectivenessofthehumanimmunesystem,andhasawiderangeofmarketprospectsinthefieldsofmedical,foodandcosmetics.ButtheexistingproductioncapacityofGSHisfarfromthemarketdemand.UsemicrobialfermentationtotranslatecheaprawmaterialsintohighyieldedGSH,andestablishsuitableindustrializationseparationandpurificationofGSHwillbringenormoussocialandeconomicbenefits.Inthispaper,themainresearchcontentandresultsareasfollows:(1)UsingPlackett-BurmanandBox-BehnkenexperimentaldesignoptimizedmediumofSaccharomycescerevisiaeY-14whichproducingGSH.Theoptimummediumwasglucose20g/mL,yeastextract10g/mL,(NH4)2SO48g/mL,KH2PO43g/mL,MgSO40.15g/mL.TheoptimumexperimentshowedthatGSHyieldreachedto124.77mg/L.(2)UsingsinglefactorteststudiedthefermentationconditionsofyeastY-14producingGSH.Theoptimumshake-flaskfermentationconditionswasculturetemperature30℃,initialpH6.0,shakespeed180rpm,liquidvolume30mL/300mL,mediumbatchaddtime20h.GSHcontentreachedto31.56mg/g,GSHyieldreachedto249.2mg/L,increased102%comparetotheoriginal.(3)Using10Lautomatedfermentor,①usingsingleconstantspeedfedglucosemedium,addedprecursorsofaminoacidsandATPat20h,andtheGSHyieldreachedtomaximum243mg/Lat52h.②usingconstantflowincreasestotalnutrientmedium,addedfedmediumat36h,GSHyieldmaximumreachedto520.742mg/L.ItshowedthatdrycellweightandGSHyieldincreased122.5%and114.2%respectivelycomparedtothefirstfermentorcultivation.

(4)UsingD001macroporousresinroughtoseparateGSH,theoptimumseparationconditionswas:samplepH3.0,sampleconcentrationwas61.4mg/100mL,sampleflowrateof0.5mL/min,impuritieswashingliquidwasabsolutealcohol,eluatewas1.5%HCland0.3mol/LNaCl,elutionflowratewas3mL/min,theaverageyieldofGSHwas69.11%,proteinremovalratewas64.8%.ThenusingSephadexG-10todesaltandpurifyGSH,theoptimumconditionswas:Φ1.6cm×25cmchromatographycolumns,sampleconcentrationwas116.66mg/100mL,samplevolumewas20mL.TheaverageyieldofGSHwas96.21%.Intheend,usingSephadexG-10topurifyGSH,usingΦ1.6cm×50cmchromatographycolumns,theoptimumsamplevolumewas2mL,theaverageyieldofGSHwas99.26%,proteinremovalratewas56.5%.Theaverageofconcentrationmultipleandpurificationmultiplewas9.07and8.67respectively.Keywords：SaccharomycescerevisiaeY-14,Glutathione,Fermentor,D001macroporousresin,SephadexG-10

目录摘要 IAbstract II目录 III第1章引言 11.1谷胱甘肽概述 11.1.1谷胱甘肽结构和性质 11.1.2谷胱甘肽的生理功能及其应用 31.2发酵法生产谷胱甘肽的国内外研究动态 41.3本研究的意义、目的及内容 91.3.1意义 91.3.2目的 91.3.3研究内容 101.4常用研究指标的说明 10第2章啤酒酵母Y-14发酵GSH培养基的优化 112.1材料 112.1.1菌种： 112.1.2培养基： 112.1.3主要试剂 122.1.4主要仪器 122.2方法 122.2.1菌株活化 132.2.2种子摇瓶培养 132.2.3摇瓶发酵培养 132.2.4菌种的保藏 132.2.5DTNB法检测GSH含量 132.2.6试验设计方法 132.3结果与分析 142.3.1显著影响因素的筛选结果 142.3.2Box-Behnken设计进一步优化培养基试验结果 162.4结论 19第3章啤酒酵母Y-14产GSH发酵条件的优化 203.1材料 203.1.1菌种： 203.1.2培养基： 203.1.3主要试剂 213.1.4主要仪器 213.2方法 213.2.1啤酒酵母Y-14生长曲线的测定 213.2.2发酵周期的优选试验 213.2.3发酵温度的优选试验 213.2.4发酵初始pH的优选试验 223.2.5发酵摇床转速的优选试验 223.2.6发酵摇瓶装液量的优选试验 223.2.7摇瓶发酵产GSH的进程试验 223.3结果与分析 223.3.1啤酒酵母Y-14生长曲线的绘制 223.3.2发酵周期的优选试验结果 233.3.3发酵温度的优选试验结果 243.3.4发酵初始pH值的优选试验结果 243.3.5发酵摇床转速的优选试验结果 253.3.6发酵摇瓶装液量的优选试验结果 263.3.7摇瓶发酵产GSH进程曲线的绘制 273.4结论 28第4章10L自动发酵罐扩大发酵的初探 294.1材料 294.1.1菌种： 294.1.2培养基 294.1.3主要试剂 304.1.4主要仪器 304.2方法 304.2.1斜面种子培养 304.2.2一级种子摇瓶培养 314.2.3二级种子摇瓶培养 31发酵罐流加培养试验 314.2.5分析方法 314.3结果与讨论 324.3.1第一批发酵罐补料培养 324.3.2第二批发酵罐补料培养 364.4结论 40第5章啤酒酵母Y-14中复原型GSH的别离纯化 415.1材料 415.1.1菌种 415.1.2主要材料 425.1.3主要设备 425.2方法 425.2.1GSH提取液的制备 425.2.2检测方法 425.2.3相关数据的计算公式 425.2.4D001大孔树脂离子交换柱的试验流程 435.2.5D001大孔树脂别离GSH的研究 435.2.6SephadexG-10凝胶柱的试验流程 445.2.7SephadexG-10纯化GSH的研究 455.3结果与分析 465.3.1D001大孔树脂别离GSH的研究结果 465.3.2SephadexG-10脱盐纯化GSH的研究结果 505.3.3SephadexG-10分级别离纯化GSH的研究结果 535.4结论 56第6章总结与展望 576.1总结 576.2创新点 586.3展望 58参考文献 59致谢 64第1章引言据报道，人体内有一种神奇的物质，它和人的健康状况有直接的关系。这种神奇的物质，科学上称之为谷胱甘肽(GSH)。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成，具有较高的营养价值，具有保肝、抗氧化的作用，含有丰富的氨基酸、肽类物质、维生素、微量元素。近日，据有关病毒学家介绍：每天补充50毫克GSH，可快速产生复原性免疫细胞，增强人体免疫力。如果人体免疫能力强，就算被感染上病毒，也会将病毒的侵害降低到最低限度。美国著名的医学专家古特曼博士这样预测：“谷胱甘肽很快就会像胆固醇一样，成为人们衡量健康指标之一。1.1谷胱甘肽概述谷胱甘肽结构和性质谷胱甘肽，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的生物活性三肽化合物[1]，广泛存在于生物体内的最丰富的非蛋白硫醇化合物[2]。其化学名为γ-L-谷氨酰-半胱氨酸-甘氨酸[3](英文名：γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，简写为GSH)，其结构式如图1所示：图1.1GSH的化学结构式图Fig1.1Chemicalstructuralofglutathione1888年Pailbode首先发现GSH，1921年Hopkins[4]从酵母抽提物和动物肝脏中首先别离得到GSH结晶并命名，1929年Hopkins、Kendall等提出GSH为三肽并初步提出它的结构，1935年由Harington和Mead说明其化学结构并加以化学合成[5]，随后在1936年被DuVigneaud和Miller验证[6]，1938年利用酵母制备GSH的最早专利发表。Bloch最早在肝脏中研究了GSH的生物合成，并证实了细胞内的GSH是由L-Glu、L-Cys和Gly在ATP的存在下，经过γ-L-谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶催化的序贯反响合成的。如图1-2所示[7]：图1.2GSH细胞内合成途径Fig1.2IntracellularsynthesispathwaysofGSHGSH的相对分子量为307.33，熔点189～193℃，等电点为5.93，晶体呈无色透明细长柱状。比旋光度[α]EQ\S(20,D)为+17.60°(C=0.05，H2O)，它易溶于水、稀醇、液氨和N,N'-二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等有机溶剂。GSH在高水分活性下不易保存，只有将水分活性控制在0.3以下才能长期稳定保存。早在1921年，Hopkins首先发现GSH，它分为复原型GSH和氧化型GSSH两类[8]。通常人们所指的谷胱甘肽是复原型谷胱甘肽，GSH固体较为稳定，但其水溶液在空气中极易被氧化成GSSH。GSSH是由两分子GSH经氧化脱氢而形成的以二硫键连接的二聚体，一般以水合物的形式存在。它可以由谷胱甘肽复原酶利用NADPH作为电子供体复原成GSH，如图1.3所示[9]:GSSH+NADPH+H+2GSH+NADP+图1.3GSH与GSSG之间的相互转换方程式Fig1.3TheinterconversionformulaofGSHandGSSG酵母细胞中氧化型和复原型谷胱甘肽之间的相互转化过程，如图1.4所示：图1.4GSH与GSSG之间的相互转换过程图Fig1.4TheinterconversionprocessofGSHandGSSG谷胱甘肽的生理功能及其应用单态氧、超氧化物阴离子、羟基离子、过氧化氢等物质统称为活性氧簇，(Reactiveoxygenspecies简称为ROS)[10]，即自由基。机体内新陈代谢产生的许多自由基会损伤细胞膜，侵袭大分子，促进机体衰老，并诱发疾病的产生。GSH可作为抗氧化剂通过氧化复原反响系统去除自由基[11]，被称为长寿因子和抗衰老因子。GSH分子中含有一个特异的γ-肽键，由谷氨酸的γ-羧基与半胱氨酸的α-氨基缩合而成，并且半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼巯基，是GSH许多重要生理功能的结构根底。GSH这个积极的多肽化合物拥有着多功能的特性，被称为最重要的可自我产生的防卫分子[12]，主要表现在三个方面：抗氧化剂[13]、提高免疫力[14]、高等真核生物有机体的解毒剂[15]等。GSH在临床应用上具体表现为：(1)保护肝脏，治疗各种肝类疾病[16]。GSH强大的复原作用使肝细胞膜对氧自由基的耐受性增加，从而使GSH具有促进肝功能，保护肝细胞膜，提高肝脏酶的活性，加快黄疸的消退，增强肝脏解毒等功能，可用于辅助治疗重型病毒性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝，对药物性肾和肝损害也有保护作用[17]。(2)治疗肿瘤，减轻化疗和放疗的副作用[18]。GSH能激活多种酶(如巯基-SH酶)，从而促进糖、脂肪和蛋白质代谢，并影响细胞的代谢过程，同时通过巯基与体内自由基结合，可以转化成容易代谢的酸类物质，从而加速了放化疗产生的自由基的排泄。(3)解除中毒，减轻空气污染和食物中的有毒成分对人体造成的伤害。GSH能与进入机体的有毒化合物(如：丙烯腈、氟化物、CO)、重金属离子等直接结合，并促其排出体外，起到中和解毒的作用[19]。(4)可以防止皮肤黑色素沉积，防止新的黑色素形成并减少其氧化[20]。(5)治疗眼科疾病，特别是应用于白内障的治疗[21]。GSH高浓度存在于眼组织的水晶体、角膜、视神经、视网膜及睫状体内，有益于角膜或水晶体透明性的维持以及组织再生与修复。(6)其他功能。人体中如缺乏GSH可以引起肺部疾病、胃肠疾病、胰脏炎症、神经变性疾病、加速衰老等病症[22]，近年来发现，GSH的缺乏还会导致小儿恶性营养不良症、癫痫发作、帕金森综合症、囊性纤维化、镰状细胞性贫血、人体免疫缺损病毒入侵、艾滋病、癌症、心脏病、中风、糖尿病等疾病[23]。因此GSH正代表着一个巨大的潜在价值在临床治疗战略中发挥举足轻重的作用[24]。1.2发酵法生产谷胱甘肽的国内外研究动态由于GSH具有重要的生理功能和广泛的市场前景，因此GSH的工业化生产越来越受到关注。GSH的生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中发酵法是最具潜力的方法。利用特定微生物的代谢将廉价原料转化为GSH的方法。即构建GSH合成能力强和胞内含量高的微生物，筛选和优化培养组分，改良提取工艺，最终提高GSH的产率和质量。自1938年实现了由酵母制备GSH以来，发酵法生产GSH的工艺及方法不断得到改良，且发酵使用的细菌或酵母容易培养，原料容易获得，条件容易控制，因此发酵法已成为目前生产GSH最普遍的方法。目前实现GSH规模生产的国家是日本。世界主要的氨基酸制造商Kyowa、Aji-nomoto和Deguss等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发，仅Kyowa1998年氨基酸的研究与开发就消耗达1.9亿美元，而GSH是其重点之一，Kyowa目前是GSH主要的供给商(中国发酵网〕。GSH市场需求较大，但由于酵母细胞的GSH含量较低(仅为细胞干重的0.5%～1.0%)、酵母用量大、收率低等缺点，现有生产能力不能满足市场需求，所以加紧对发酵法生产GSH的研究已成为国内当务之急。下面着重对发酵法生产GSH的关键技术环节：富含GSH菌种的选育、发酵过程的优化与放大及GSH的别离提取工艺等详述。一、菌种选育普通酵母菌体中GSH的含量一般不超过细胞干重的1.0%，但有一些酵母菌，如Saccharomycesglyoxalphilus、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和Saccharomycescystinovolens、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其菌体内GSH含量较高，且能长时间保持合成GSH的能力[17]。Kimura等[25]采用亚硝基胍和紫外线诱变大肠杆菌B355，获得高产GSH的优良突变株，GSH的含量到达2.43mg/g。浙江工业大学贾建萍、裘娟萍[26]以编号为346的酿酒酵母为出发菌株，通过紫外线和60Co射线诱变处理，选育到1株抗氯化锌和乙硫氨酸的突变株0.5Eth400-5，该菌株经摇瓶发酵GSH产量到达165.96mg/L，较出发菌株提高350%，GSH的含量19.76mg/g，较出发菌株提高318.6%。陕西省微生物研究所詹谷宇等[27]在酵母菌的诱变育种中用GSH的代谢类似物乙硫氨酸作为抗性筛选物，筛得抗代谢类似物突变株KllUE126，其胞内累计GSH的含量到达26.9mg/g，比出发菌株高出49.7%，这是我国目前通过常规诱变方法获得的GSH含量最高的菌株。Kono等[28]用产朊假丝酵母经紫外线、x射线或亚硝基胍作用，得到的蛋氨酸耐性突变株，再经同样处理，得到同时耐亚硫酸盐和乙硫氨酸的变异株，其胞内GSH含量可达4.0%，而出发菌株仅为0.52%。这是目前国外文献报道中GSH含量最高的。二、发酵过程的优化及放大①培养基碳源日本学者Sakato[29]研究说明，葡萄糖添加是工业化生产GSH的关键因素之一。通过在线监测发酵液中溶氧和乙醇的浓度，运用前馈/反响控制系统控制葡萄糖的流加速率，GSH产量到达2360mg/L，细胞内GSH含量到达37mg/g，这是所查文献报道中GSH产量最高的。Chi-Hsien等[30]认为葡萄糖是啤酒酵母()生长的最正确碳源，蛋白胨是最正确氮源。卫功元，李寅等[31]针对假丝酵母的生长特征以及GSH生物合成的要求，选择葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、麦芽糖、果糖和可溶性淀粉等物质进行考察，结果显示C.utilisWSH02～08根本上不能利用乙酸和可溶性淀粉，葡萄糖更有利于促进GSH的合成，且可以将胞内GSH含量一直保持在较高水平。由于葡萄糖是速效碳源,它的初始浓度对GSH的积累非常重要，时丽萍，郭学武等[32]考察不同的葡萄糖初始浓度对酵母中GSH积累的影响，结果显示，当初糖浓度逐渐升高时，生物量在增加，但GSH的含量却在降低。GSH的产量和含量在葡萄糖初始浓度为30g/L时到达最高。饶志明，艾丽静等[33]分别选择葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉作为碳源，结果发现，在以甘油为碳源的培养基上，重组毕赤氏酵母的生物量及GSH含量均达最高值。经培养基成分和培养条件优化后，重组酵母的GSH产量是98.5mg/L，为优化前的2.33倍，生物量最大值到达19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验，发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L，18.7g/L与摇瓶发酵结果根本吻合。江南大学陈坚等[34]考察了葡萄糖浓度对面包酵母(Saccharomycescerevisiae)WSH-J发酵生产GSH的影响，结果说明，当葡萄糖起始浓度超过12g/L时，胞内GSH含量减少，葡萄糖总浓度为30g/L的发酵液中，GSH总量达90.2mg/L，而葡萄糖总浓度为10g/L时，发酵液中GSH总量仅为65.6mg/L。应用计算得出的一种以控制比生长速率为目的的摇瓶补糖策略，在总糖浓度为26.2g/L下发酵12h，最终细胞胞内GSH含量到达13.6mg/g，发酵罐内GSH总产量到达119.4mg氮源氮源是构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。GSH是一种含氮量(13.68%)较高的物质，因此在生物合成GSH的过程中，适宜的氮源供给是非常必要的。时丽萍，郭学武等[32]分别考察了有机和无机氮源对酵母积累GSH的影响，结果显示，酵母粉为最适宜的有机氮源，可能是因为酵母粉中含有多种生长因子和氨基酸，能够促进细胞的生长和GSH的合成。酵母粉的添加对酵母的生长和GSH的积累均有利。当酵母粉的浓度超过9g/L时，对GSH的积累产生了一定的抑制作用。因此，最适的酵母粉添加浓度为9g/L。硫酸铵为最适的无机氮源，硫酸铵浓度为9g/L时，GSH的产量和含量明显高于其他浓度，故此浓度为最适浓度。经培养基成分和发酵条件优化后GSH的产量为96.72mg/L，GSH含量为18.85mg/g，为初始含量的1.33倍。江南大学陈坚等[34]考察了氨基酸和酵母膏的添加对面包酵母(S.cerevisiae)WSH-J发酵生产GSH的影响，结果说明培养基中添加L-半胱氨酸、蛋氨酸能提高细胞内GSH的含量；L-半胱氨酸的效果更显著，但对细胞生长有一定的抑制作用；添加由L-半胱氨酸、谷氨酸与甘氨酸组成的混合物也能提高细胞胞内GSH的含量。贺小贤，赵少欣等[35]通过正交试验，对啤酒酵母摇瓶发酵生产GSH的培养基的组成进行研究，研究结果说明，在蔗糖浓度2%、酵母膏浓度1%、(NH4)2SO4浓度0.6%、半胱氨酸浓度为4mmol/L时，优化发酵条件，GSH产量可达248mg/L，比发酵条件优化前提高了37%。Alfafara[36]等研究了半胱氨酸的补加策略，实验结果说明，连续流加后期，细胞比生长速率和GSH比生产速率皆下降，整个发酵过程中GSH含量与不加半胱氨酸相比，无显著提高；而一次性补加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生产速率。北京化工大学谭天伟等[37]在S.cerevisiaeT65发酵生产GSH过程中，采取先参加半胱氨酸再参加谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸混合物的策略，含量到达1875mg/L，比不加谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸混合物的产量提高了55.2%。②培养条件时丽萍，郭学武等[38]对面包酵母BY-14产GSH的摇瓶发酵条件进行了优化，其最适的培养条件为：转速160r/min，发酵时间22h，温度28℃，接种量10%，装液量50mL。在优化的条件下，GSH的含量到达16.04mg/g，为初始条件下的1.48倍。卫功元，李寅等[39]在7L发酵罐中研究了溶氧和pH对产朊假丝酵母分批发酵生产GSH的影响。结果说明，当葡萄糖浓度为30g/L且通气量控制在5L/min时，搅拌转速到达300r/min，即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求。不同pH控制方式对GSH分批发酵的影响有较大差异。研究了将pH控制在4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的GSH分批发酵过程，发现在pH5.5时GSH总产量最高。同时研究了24～32℃范围内产朊假丝酵母生产GSH的分批发酵过程，发现较高温度(30℃)对细胞生长有促进作用，而较低温度(26℃)那么更有利于GSH产量的提高。采用两阶段温度培养方式，用较高温度(30℃)促进细胞生长，较低温度(26℃)促进GSH形成，GSH产量较26℃培养提高5%，较30℃培养提高了23%，GSH含量也上升到2.5%。③培养方式卫功元，李寅等[40]考察了重复补料、恒速流加和指数流加等不同培养方式对产朊假丝酵母中GSH发酵生产的影响。结果发现，这几种培养方式都可以实现酵母细胞和GSH的高产。综合比拟，无论是从细胞还是从GSH的产量、得率和生产强度的角度来看，指数流加都是较为理想的选择。经过48h的指数流加培养，细胞干重到达40.9g/L，GSH产量和胞内GSH含量分别到达857.2mg/L和2.25%。三、GSH的别离纯化工艺GSH的粗提物进一步别离纯化的方法主要有4种：(1)铜盐法，具有使用价值，但污染较大。(2)离子交换树脂法Kimura等[41]发表的专利中报道了从大肠杆菌发酵液中提取GSH的方法，发酵液离心取菌体，破碎细胞，离心取上清液，用硫酸调节pH3.0，上阳离子交换树脂如DiaionPK-228H.sup+，用0.5mol/l的氨水洗脱，洗脱液用硫酸调节pH到4.5，上阴离子交换树脂如DuoliteA2CH3COO.sup-，用0.5mol/l的硫酸洗脱，参加50%的乙醇到洗脱液中得到GSH晶体。蔡俊，邱雁临[42]对使用732阳离子交换树脂法提取GSH时的提取条件进行了研究，确定最正确提取工艺条件上柱pH3.0，洗脱用氢氧化钠浓度0.25mol/L，洗脱流速30cm/min，此条件下GSH的平均回收率为53.06%，产品GSH含量为2.953%。可以制得GSH淡黄色晶体。邱雁临，胡静等[43]对大孔树脂D001别离啤酒废酵母中的GSH进行了研究。其最正确试验条件为：pH4.5的0.02mol/L磷酸缓冲液平衡，pH7.5的0.02mol/L磷酸缓冲液洗脱，洗脱流速为2.0mL/min。在最正确别离条件下，大孔树脂D001别离GSH的平均收得率为20.03%，产品中GSH的含量为28.47%，产品颜色为白色。赵睿，王满意等[44]利用大孔苯乙烯树脂改性合成含硫树脂，考察了修饰条件对GSH吸附的影响，并对其在GSH别离中的应用进行了研究。结果说明采用pH3.0的缓冲液进行吸附，自制的含硫树脂最大吸附容量可达22mg/g湿树脂。选择质量浓度为0.5%的NaOH溶液洗脱GSH，解吸率可达70%以上。采用真实发酵液进行别离纯化，收率为35%。苏晓晋，王淼等[45]确定了GSH最正确的洗脱条件：先用pH3.0的去离子水洗涤柱子，直到洗涤液中无GSH和蛋白质流出。再采用浓度为1.5%HCl溶液进行洗脱，速度为0.5mL/min，最终的GSH回收率到达80.2%，蛋白质去除率60%，GSH浓缩倍数达2.5倍(顶峰时到达8.3倍)，纯化倍数为3.9倍，获得了良好的别离效果。(3)电渗析法TakeshiGotoh[46]等用电渗析法从酵母提取液中别离GSH，由于GSH在碱性条件下易于被氧化，电渗析是在pH值3～6进行，克服了GSH的不稳定性。(4)双水相分配结合温度诱导相别离可以省去细胞破碎后的固液别离操作，并且利用温度诱导相别离能实现聚合物的循环利用。梅乐和等选用环氧乙烷-环氧丙烷无规共聚物(EOPO)/羟丙基淀粉(PES)双水相系统，在EOPO400013%，PES10010%，pH10.5的条件下，结合温度诱导相别离技术从酵母细胞中提取GSH，GSH的总萃取率达80%以上，但因双水相组成系统一般比拟昂贵，此法目前还处于实验室研究阶段。1.3本研究的意义、目的及内容意义GSH具有去除自由基、维持DNA生物合成、促进铁质吸收、维持细胞正常生长、维持红细胞的完整性、细胞免疫等生理功能。在临床应用上，主要表现在肝炎治疗、减轻化疗副作用、有机物及重金属的解毒、抗过敏、眼疾病的改善等作用。在化装品领域中，它有抗衰老、增白、祛斑等作用。在食品加工领域，GSH具有防褐变、使食品增鲜、营养增强等成效。日本早在1985年就取得了中国卫生部的原料药进口许可证号，根本垄断中国市场。目前GSH的主要生产厂家有美国的Sigma、JTBaker、Fluka等公司，日本有协和公司、和光纯药公司等，德国有默克和BDH公司等。实现GSH的国产化，不仅可以改变我国GSH原料药依赖进口的局面，而且对我国医药工业、临床医学和食品工业均具有重大的社会意义和经济效益。目的研究目的：在本实验室前期研究的根底上，用实验室现有的富含GSH的啤酒酵母Y-14进行发酵生产GSH工艺的优化及放大试验、采用离子交换法及凝胶双柱精制GSH的方法，最终到达提高GSH的回收率及产品质量的目的。

研究内容1、利用Plackett-Burman设计和Box-Behnken设计对富含GSH啤酒酵母Y-14摇瓶发酵GSH工艺进行优化，并利用SAS软件进行回归分析确定发酵培养基最正确组成成分。2、利用单因素试验对啤酒酵母Y-14生产GSH发酵条件进行优化，确定摇瓶发酵温度、初始pH、摇床转速及装液量的最优值。3、将上述最正确试验条件运用到10L发酵罐发酵生产GSH的扩大重复试验当中，以确定最有利于工业生产的试验方案。4、以GSH吸附率、GSH回收率、蛋白质去除率、浓缩倍数、纯化倍数为主要指标，研究确定大孔树脂D001别离GSH的最适上样浓度、上样pH、上样流速、洗杂质用液种类、洗脱液种类与浓度及洗脱流速。后采用SephadexG-10凝胶双柱精制GSH，研究最适的脱盐上样体积与浓度，分级别离上样体积，到达较理想的GSH纯化效果。1.4常用研究指标的说明为了防止重复，在此对本论文所用到的各项研究指标进行简要说明。菌体胞内GSH的含量：表示每克干菌体胞内GSH的含量，简称GSH含量，单位为mg/g；GSH的产量：表示每升发酵液中总干菌体胞内GSH的含量，简称GSH产量，单位为mg/L；生物量：表示每升发酵液中菌体烘干后的重量，单位为g/L。GSH产量〔mg/L〕=GSH含量〔mg/g〕×生物量〔g/L〕

第2章啤酒酵母Y-14发酵GSH培养基的优化生产GSH的酵母大都是工业常用菌株，这些菌株能在宽松的培养条件下生长并积累GSH，但产量往往很低。在实际的发酵生产中，选育性能优良的菌种仅仅是一个开始，还需要对发酵过程进行优化控制，最大限度地发挥其生产目标产物的能力。要想进一步提高菌株的生物量和胞内合成GSH能力，必须对培养基中各种营养成分进行优化，确定适合菌株生长最适培养基。一些试验设计(如正交试验设计、因次分析设计、中心复合试验设计等)及数据处理方法(如Plackett-Burman试验设计、响应面分析、神经网络模型)的应用可以减少工作量并且使试验结果具有更高的可信度和实际应用价值。Udeh和Achremowics考察了培养基中的主要成分(葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、生物素和半胱氨酸)浓度的变化对酵母S.cerevisiaeS-8H细胞形成和胞内GSH含量的影响，采用中心复合试验设计(CentralCompositionExperimentalDesign)方法对发酵培养基进行优化，得到GSH产量为160.1mg/L，胞内GSH含量到达1.7%，与优化前的情况相比提高近一倍[47]。李寅[48]等采用正交试验获得的试验数据，通过网络模型(NeuralNetworkModel)进行分析预测，对C.utilisWSH02～08发酵生产GSH的培养基进行优化，摇瓶条件下GSH胞内含量达2.5%，GSH产量和细胞干重也有大幅度的提高。本章以啤酒酵母Y-14获得GSH的产量为指标，采用Plackett-Burman设计对影响GSH生产的14个营养因素进行考察，再用Box-Behnken设计对培养基成分进一步优化，对所得的实验数据与响应面模型进行拟合，利用SAS(version9.0,SASInstituteIne,Cary,NC,USA)处理分析，确定最后的优化结果。2.1材料2.1.1菌种：啤酒酵母Y-14，由XXXX大学工业微生物湖北省重点实验室再生资源微生物转化研究室提供。2.1.2培养基：.1斜面培养基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，琼脂20，pH6.0，0.115MPa灭菌15min。.2种子培养基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，pH6.0，0.115MPa灭菌15min。.3原始发酵培养基(g/L)葡萄糖20，酵母膏5，(NH4)2SO47.5，KH2PO43，MgSO40.15，水1000mL，pH6.0，0.115MPa灭菌15min。2.1.3主要试剂葡萄糖AR广州化学试剂厂蛋白胨BR国药集团化学试剂牛肉浸膏BR上海长阳生化制药厂(NH4)2SO4AR北京益利精细化学品MgSO4·7H2OAR金山县兴塔化工厂KH2PO4AR湖州化学试剂厂DTNBARSigma，武汉新锐生物分装98%GSHARSigma，武汉新锐生物分装2.1.4主要仪器GW-722型可见分光光度计上海精密仪器303-2电热培养箱上海崇明实验仪器厂HS80A恒温摇床中国科学院武汉科学仪器厂320-SpH计梅特勒-托利多(上海)电子分析天平奥豪斯国际贸易(上海)15W紫外灯顺德市展达电器厂CS101-2电热鼓风枯燥箱中华人民共和国重庆试验仪器设备厂珍珠牌净化工作台中华人民共和国蚌埠汽化设备厂2.2方法2.2.1菌株活化从保藏斜面中取一环菌种划线于新鲜斜面培养基上，置于30℃培养箱中培养。种子摇瓶培养用接种环取一满环已活化的菌种于种子培养基中，在温度为30℃，摇床转速150rpm，摇瓶装量50mL/250mL条件下培养18h。摇瓶发酵培养用无菌的5mL移液管按10%的接种量吸取种子液3mL，接入发酵培养基中，在温度为30℃，摇床转速150rpm，摇瓶装量30mL/300mL条件下发酵48h。菌种的保藏菌种接于斜面培养基上4℃冰箱保藏。DTNB法检测GSH含量[49]取样液2mL，参加0.4mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液2.5mL，1.0mmol/LDTNB显色剂0.5mL，反响数分钟后显色稳定后于412nm处用分光光度计测定OD值。2.2.6试验设计方法1)Plackett-Burman设计[50]对影响GSH生产的14个营养因素进行考察,每个因素取2个水平，各因素及其水平见表1，试验设计见表2，表2中每行代表1个试验，每列代表1个独立的变量，符号“+〞和“-〞分别代表高和低2个不同的水平。2)Box-Behnken设计对培养基成分的进一步优化[51]对Plackett-Burman设计试验筛选出的有较大影响因素，利用Box-Behnken设计对培养基进一步的优化。每个因素取3个水平，在中心点上有3个重复。试验数据经多项式回归分析得到一个关于响应值与自变量关系的二阶模型，该方程即为描述响应量(应变量)和自变量(操作条件)关系的经验模型。3)对优化试验所得的实验数据与响应面模型进行拟合，便可以得到模型中的各个系数。再对该多元函数进行分析便可确定出其极值点以及取得极值的相应的自变量的取值。最后按照计算所得到的参数进行试验验证模型的可靠性，确定最后的优化结果。试验数据均用SAS(version9.0,SASInstituteIne,Cary,NC,USA)处理分析。2.3结果与分析2.3.1显著影响因素的筛选结果根据啤酒酵母生长所需营养要素并结合相关的文献报道，试验选取的影响因素(变量)共14个，表2.1列出了14个营养因素的编号及水平，A-N编码了14个因素，表2.2列出了Plackett-burman设计的不同培养基，标号为1-16，每行代表1个试验，按照设计的培养基进行发酵试验，每组重复3次，结果见表2.2。表2.1Plackett-Burman试验因素与水平Tab2.1ThefactorsandlevelsofvariablesusedinthePlackett-Burmandesign试验因素代码-(-)低水平〔g/L〕(+)高水平〔g/L〕酵母膏X139蔗糖X2010蛋白胨X3010K2HPO4X426酪蛋白X5010葡萄糖X6010MgSO4X70.10.3麦芽糖X8010NaClX926(NH4)2SO4X10412乳糖X11010可溶性淀粉X12010Cacl2X1303尿素X14010表2.2Plackett-Burman试验设计和结果Tab2.2ExperimentaldesignandresultsofPlackett-BurmanX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14Y**1-1-1-1-11-1-11-111-11130.8721-1-1-1-1-11111-111-168.583-11-1-1-11-111-111-1150.25411-1-11111-1-1-1-1-1-182.085-1-11-1-111-1-1111-1-177.6461-11-111-1-111-1-1-1190.67-111-11-11-11-11-11-125.548111-1-1-1-1-1-1-1-111149.879-1-1-11-111-11-1-1-11155.07101-1-1111-1-1-1-1111-170.4911-11-111-11-1-11-11-1168.751211-11-1-1-1-1111-1-1-170.8313-1-1111-1-111-1-11-1-140.46141-111-1-111-1-11-1-1175.3815-1111-11-11-11-1-11-190.871611111111111111121.2注：Y**表示GSH产量，单位为mg/L。表2.3Plackett-Burman设计试验的的回归系数及其显著性检验Tab2.3RegressioncoefficientsandtheirsignificancetestofPlackett-BurmandesignEffectEstimateStdErrortRatioPValueX123.7041.548715.3050.0415X26.29831.54874.06380.1536X39.33631.54876.02820.1047X414.7091.54879.49720.0668X5-1.05621.5487-0.6820.6190X625.9661.548716.7850.0379X710.0061.54876.46090.0978X86.36881.54874.11220.1519X9-2.92131.5487-1.88620.3103X1021.2811.548713.7410.0462X11-3.00371.5487-1.93950.3031X123.25621.54872.10250.2826X13-5.43131.5487-3.50690.1768X141.94371.54871.2550.4283利用SAS软件对Plackett-Burman试验结果进行方差分析，结果见表2.3，Pr>F值(P值)的大小说明模型及各个考察因素的显著水平。Pr>F值小于0.05说明模型或各因素有显著影响，Pr>F值小于0.01表示影响高度显著。其中X1，X6，X10是有意义的模型参数，因为Pr>F值均小于0.05。所以对应的因素葡萄糖，酵母膏和(NH4)2SO4对GSH的产量具有显著性的影响，而其它的因素显著性较小。2.3.2Box-Behnken设计进一步优化培养基试验结果以主要影响GSH产量的葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的浓度(g/L)为自变量，各因素编码水平如表2.4所示。Box-Behnken试验设计和试验结果如表2.5所示。表2.4Box-Behnken试验因素与水平Tab2.4ThefactorsandlevelsofvariablesusedinBox-Behnkendesign试验因素代码编码水平/(g/L)-10+1葡萄糖X1102030酵母膏X251015(NH4)2SO4X34810表2.5Box-Behnken试验设计和试验结果Tab2.5ExperimentaldesignandresultsofBox-Behnken试验编号X1X2X3Y**1-1-1078.652-11085.0331-1089.58411095.8150-1-176.3160-1172.83701-197.78801187.929-10-180.151010-190.0511-10173.231210189.5613000123.2914000123.5815000124.77采用国际权威的SAS软件回归拟合表试验数据，可以得到二阶经验模型为Y=123.6267+5.9925×X1+6.14625×X2-2.59375×X3-18.41083×X1×X1-17.94833×X2×X2-21.96833×X3×X3式中，Y代表GSH产量，X1、X2、X3分别代表培养基中葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的浓度(g/L)。通过SAS软件进行方差分析来验证回归模型及各参数的显著度，结果见表2.6，模型Pr>F值为0.000763，说明该模型是高度显著的。经F检验，模型中的参数X1，X2，X1X1，X2X2，X3X3都是显著的(Pr>F值小于0.05)。同时，软件分析得到模型的决定系数R2为98.21%，大于90%，修正决定系数Adj.R2为94.99%，能对试验数据进行较好的拟和，说明模型相关度很好。变异系数(CV)反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高,本试验的CV值为4.293957%，说明模型方程能够很好地反映真实的试验值。表2.6回归方程的方差分析Tab2.6Varianceanalysisoftheregressionequation方差来源自由度平方和均方F值Pr>FX11287.2804287.280418.202540.007966X21302.2111302.211119.148570.007182X3153.8203153.820313.4101390.124081X1×X111251.541251.5479.299540.000297X1×X210.0056250.0056250.0003560.985668X1×X3110.3362310.336230.6549190.455129X2×X211189.451189.4575.36540.000335X2×X3110.176110.17610.6447740.458441X3×X311781.9361781.936112.90630.000128Model94331.44481.271230.494090.000763一次项3643.3119214.437313.587080.007718二次项33667.6111222.53777.461850.00013交叉项320.517956.8393170.433350.738594残差项578.9121915.78244失拟项378.6497326.21658199.77070.004985误差20.2624670.131233和144410.353R-square98.21%Adj.R-square94.99%RMSE3.972712%CV4.293957%在保持1个因素为零水平下，其它2个因素与响应值关系用三维坐标图2.1表示，直观地反响了各因素对响应值的影响关系。在最优条件下：葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4分别为20g/L、10g/L、8g/L时，预测GSH最大产量为124.80mg/L。为验证模型准确性和有效性，在预测最优发酵条件下进行发酵试验(重复3次)，得到GSH产量分别为123.58mg/L、121.65mg/L、124.77mg/L。可见该模型能较好预测发酵所产GSH产量。因此，最优发酵培养基的组成为葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15Fixedlevels：X1=0Fixedlevels：X2=0Fixedlevels：X3=0图2.1GSH产量的响应面分析图Fig2.1ResponsesurfaceanalysisofGSHyield2.4结论Plackett-Burman设计法是一种经济且有效的试验设计方法，它能快速、有效地从众多因子中筛选出能促进啤酒酵母Y-14高产GSH的因子；响应面法(RSM)能快速对主要影响因子进行优化与评价，并能得到各因素最正确组合和响应值的最优值。通过Plackett-Burman试验筛选出葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4是影响啤酒酵母Y-14高产GSH的关键因子，进而用响应面法优化发酵培养基,得到的最适培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15g/L。对优化配方进行验证试验

第3章啤酒酵母Y-14产GSH发酵条件的优化为了使菌株进一步提高GSH的合成能力，仅确定最正确培养基成分是远远不够的，还必须对发酵条件进行优化，为最终的工业化生产提供了实验依据。影响发酵产量的环境参数主要有温度、pH、溶解氧等。温度对菌体生长、酶活性都有直接的影响。pH影响细胞对营养成分的吸收及代谢途径，从而影响细胞生长及GSH积累。GSH发酵过程中氧的供给是个关键因素，溶氧浓度是微生物生长和GSH形成率的重要参数之一。国内对面包酵母和重组大肠杆菌发酵过程中的温度、pH值、摇瓶装液量等环境条件的影响已有较多研究，但GSH的产量均值仍不理想。另据研究说明，添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸等三种前体氨基酸及其混合物能提高细胞内GSH的含量，其中以L-半胱氨酸的效果更为显著。Miyamoto等[52]在利用甲醇作为碳源培养S.cerevisiaeIAM4207进行GSH发酵生产时发现，向培养基中添加L-半胱氨酸可以使胞内GSH含量大幅度提高，Watanabe等[53]发现，在S.cerevisiae生长稳定期之前添加混合氨基酸有利于GSH的积累。Alfafara[54]考察了S.cerevisiae摇瓶发酵生产GSH过程中这三种前体氨基酸对GSH合成的影响，结果说明，一次性补加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生产速率。本章在前一章发酵培养基优选试验的根底上，利用单因素试验分别研究了啤酒酵母Y-14发酵最适温度、初始pH、摇床转速、摇瓶装液量及添加前体氨基酸和ATP对GSH产量的影响，并确定其最优发酵条件。3.1材料3.1.1菌种：啤酒酵母Y-14，由XXXX大学工业微生物湖北省重点实验室再生资源微生物转化研究室提供。3.1.2培养基：.1斜面培养基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，琼脂20，pH6.0，0.115MPa灭菌15min。.2种子培养基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，pH6.0，0.115MPa灭菌15min。.3发酵培养基〔g/L〕葡萄糖20，酵母膏10，(NH4)2SO48，KH2PO43，MgSO40.15，水1000mL，0.115MPa灭菌15min。.4补料培养基L-谷氨酸10mmol/L，甘氨酸6mmol/L，L-半胱氨酸10mmol/L，ATP1.67µg/mL。主要试剂L-谷氨酸BR中国医药集团上海化学试剂公司L-半胱氨酸AR武汉市华顺生物技术甘氨酸BR中国医药集团上海化学试剂公司ATPBR上海源聚生物科技3.1.4主要仪器同第2章。3.2方法3.2.1啤酒酵母Y-14生长曲线的测定采用种子培养基培养菌体，利用分光光度计在波长560nm波长下，每隔2小时测定一次菌悬液的OD值，以时间为横轴，OD值为纵轴绘制其生长曲线。3.2.2发酵周期的优选试验啤酒酵母Y-14连续培养12小时，后每隔8小时取样测量生物量及GSH产量。3.2.3发酵温度的优选试验在其他发酵条件不变时，考察了当温度分别为25℃、28℃、30℃、32℃、35℃时，发酵60h时，啤酒酵母Y-14产GSH所得到的细胞干重、胞内GSH含量、发酵液中GSH产量。3.2.4发酵初始pH的优选试验在其他发酵条件不变时，考察了当pH值分别为4.5、5、5.5、6、6.5、7时，啤酒酵母Y-14产GSH所得到的细胞干重、胞内GSH含量、发酵液中GSH产量。3.2.5发酵摇床转速的优选试验在其他发酵条件不变时，考察了当摇床转速分别为120rpm、150