免疫分析专业课件

第十一章

免疫分析技术和相关仪器1欢迎下载可修改第一节酶免疫分析仪一、酶免疫分析技术的分类：酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)

根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为:

酶扩大免疫测定均相酶免疫测定克隆酶供体免疫测定

液相酶免疫法非均相酶免疫测定固相酶免疫法(酶联免疫吸附测定enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）2欢迎下载可修改需要了解的基本概念酶免疫测定（EnzymeImmunoassay,EIA)均相酶免测定对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定异相酶免测定需经过结合的标记物和游离的标记物的分离才能测定.分离的方法主要通过固相载体，故此法称为固相酶免疫测定ELISA。ELISA的测定模式:双抗体夹心法间接法竞争法3欢迎下载可修改双抗体夹心法（三明治法）原理固相支持物表面包被抗体标记抗体待测物4欢迎下载可修改夹心法的剂量--反应关系曲线信号强度（Y）线性范围待测物浓度（X）Hook效应5欢迎下载可修改竞争法的原理固相支持物表面待测物包被抗体标记抗原6欢迎下载可修改竞争法的剂量--反应关系曲线待测物浓度（X）信号强度（Y）线性范围7欢迎下载可修改间接法原理包被体待测抗体包被抗原标记抗体（二抗）8欢迎下载可修改俘获法原理俘获抗体（二抗）待测抗体标记抗原包被体9欢迎下载可修改双抗原夹心法原理包被体待测抗体包被抗原标记抗原10欢迎下载可修改9、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:48PM11、人总是珍惜为得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/2/32023/2/303February202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3

我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为酶标仪。一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能，还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐。全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能于一体。12欢迎下载可修改9、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:42:48PM11、人总是珍惜为得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/2/32023/2/303February202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪)半自动微孔板ELISA分析仪全自动微孔板ELISA分析仪管式固相酶免疫测定仪器小珠固相酶免疫测定仪器磁微粒固相酶免疫测定仪器等14欢迎下载可修改有单通道和多通道两种类型工作原理与主要结构和光电比色计相同不同之处在于：

比色液的容器是塑料微孔板以垂直光束通过待测液通常使用光密度OD来表示吸光度1、微孔板固相酶免疫测定仪器15欢迎下载可修改16欢迎下载可修改17欢迎下载可修改2、半自动微孔板式ELISA分析仪在酶标仪的基础上再配置:加液器温育器洗板机测读仪

测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。18欢迎下载可修改3、全自动微孔板式ELISA分析仪自动化酶免疫分析系统由:加样系统温育系统洗板系统判读系统机械臂系统液路动力系统软件控制系统等组成19欢迎下载可修改20欢迎下载可修改温育箱反应板迭式存储器21欢迎下载可修改X-Y头架22欢迎下载可修改

样品架

50根装

50×323欢迎下载可修改

4根独立上下吸移管24欢迎下载可修改

检

测

光

纤25欢迎下载可修改

反应板

反应板夹具26欢迎下载可修改

清洗装置27欢迎下载可修改

供水箱

废水箱28欢迎下载可修改检测时间:以乙肝两对半（立可读）为例

仪器操作各单元如下（满板）加样品时间：6-7分钟；9-10分钟（使用液面传感器）加酶时间：4分46秒(洗5遍，不浸泡)加两种显色剂A、B共：5分30秒加终止液：2分42秒读板时间：2分58秒29欢迎下载可修改优势自动化程度高：

前后处理一体化设计，减少人与样品的接触机会，降低感染。各种自动安全检测能。稳定：

只要避免人为操作错误，可连续数年良好工作。准确：

不存在交叉感染。反应振荡，确保检测准确。30欢迎下载可修改高速：

加注、读板速度快扩展性：

软件可升级，样本量增加，可联机使用用户做主更多：

开放式试剂

WINDOW操作系统中/英/日自选操作界面自定义编程自动/自定义时间表无限存档31欢迎下载可修改4、管式固相酶免疫测定仪1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配套试剂用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物ABTS测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点定标测定的精密度CV在3%左右32欢迎下载可修改5、微粒固相酶免疫测定仪美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在微粒上。第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体则通过膜滤出。以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物为4-甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。33欢迎下载可修改6、磁微粒固相酶免疫测定仪

瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和试剂组成：试剂包括：抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm）FITC结合的特异抗体或抗原碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反应液呈粉红色。什么样的反应34欢迎下载可修改磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰酸荧光素(FITC)，另将一抗FITC抗体经化学反应与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂，生成夹心免疫复合物，洗涤，加酶底物显色。35欢迎下载可修改三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养（一）评价指标和方法1．滤光片波长精度检查及其峰值测定2．灵敏度和准确度3．通道差与孔间差检测4．零点飘移5．精密度评价6．线性测定7．双波长评价36欢迎下载可修改重点是光学部分

1．滤光片波长精度检查

2．通道差与孔间差检测37欢迎下载可修改四、酶免疫分析仪的临床应用１．病原体及其抗体的检测

2．各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等

3．肿瘤标志物

4．多种激素

5．药物和毒品38欢迎下载可修改辣根过氧化物酶的色原底物HRP最常用的色原底物有:邻苯二胺(OPD)、2，2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸-6)[ABTS](杂环吖嗪)四甲基联苯胺(TMB)4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对39欢迎下载可修改OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202)氧化而聚合成2，2’-二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。40欢迎下载可修改TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。测定波长：450nm41欢迎下载可修改氧化耦联色原底物对HRP的氧化耦联色原底物对主要有4-氨基安替比林:苯酚耦联底物对(Trinder试剂)和2-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)；二甲基苯胺(DMA)耦联底物对(Ngo—Lenhoff试剂)等。在H202存在下，4—氨基安替比林和苯酚经HRP作用缩合形成红色的醌亚胺，其在492nm处有最大吸收42欢迎下载可修改9、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。03-2月-2303-2月-23Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。***2/3/20234:42:48PM11、人总是珍惜为得到。03-2月-23**Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。***Frid