植物细胞SOD的提取与分离

植物细胞SOD的提取与分离陈翰200913007012梁羽200913007011原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O-2)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢:2O-2+H2=O2+H2O2。植物叶片细胞中有较丰富的SOD,通过组织或细胞破碎后,可用PH7.8的磷酸缓冲液提取。由于不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。二材料和试剂1)新鲜植物叶片磷酸缓冲液：0.05mol/L,PH7.8的磷酸缓冲液。氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇=3:5(v/v).丙酮：用前冷却至4〜10°C。碳酸盐缓冲液：0.05mol/L,PH10.2.EDTA溶液：0.1mol/L。肾上腺素液：2mol/L。2．主要仪器:(1)可见分光光度计(2)万分之一分析天平(3)离心机(4)冰箱(5)光照箱：4500Lux(6)带盖瓷盘1个/处理(7)移液管架(8)研钵(9)离心管5mL数个(10)微烧杯10〜15mL8个/处理(11)移液管或加样器0.5mLX4；1mLX2；2mLX2；5mLX1(12)微量进样器50口LX2；100口LX2(13)烧杯50mLX3；100mLX5；500mLX1；1000mLX2(14)量筒50mLX1；100mLX2(15)容量瓶50mLX1；100mLX5；250mLX1；1000mLX2(16)细口瓶125mLX5三操作方法组织或细胞破碎称取5g左右植物新鲜叶片，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。2SOD的提取将上述破碎组织或细胞,、加入2~3倍体积的0.05mol/L,PH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min,使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000r/min下，离心15min,弃沉淀，得提取液。3除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min,5000r/min,离心15min,去杂蛋白沉淀，的粗酶液。4SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得沉淀SOD。将沉淀溶于0.05mol/L,PH7.8的磷酸缓冲液中，于55〜60°C热处理15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。5SOD活力测定取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。ml)试剂空白管对照管样品管磷酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.50.50.5蒸馏水0.50.5——样品液————0.5混合均匀肾上腺素液——0.50.5在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30C水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素(空白管不加)，继续保温反应2min,然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管于样品管的光密度值分别为A和B。在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需要的酶量定义为一个酶活力单位。即：酶活力(单位)=(2*(A-B)*N)/A式中N——样品稀释倍数2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数(100%/50%)。若以每毫升样品液的单位数表示，则按一下计算酶活力单位/ml={[2*(A-B)*N]/A}*(V/Vi)=[26*(A-B)*