细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验(cellmigrationassay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤：材料准备：可拍照显微镜，小室，孔径可拍照显微镜，小室，孔径8pm，没包被胶的 和 公司的也较常用， 迁移实验的细胞培养板孔板。细胞培养板应当与购买的 小室相配套， 公司的 ，无血清完全培养基， 完全培养基（也可加到醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（ （步骤和流程相配套， 公司的 ，无血清完全培养基， 完全培养基（也可加到醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（ （步骤和流程基质胶铺板：用公司的 ：（根据细胞产生胎牛血清和 培养基，血清），无菌，棉签，胰酶，多聚甲）结晶紫）的量来决定）稀释，包被小室聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。底部膜的上室面，置°C 使制备细胞悬液制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿－ ，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 洗－遍），用含 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 。接种细胞取细胞悬液 加入 小室。孔板下室一般加入 含 的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。培养细胞：常规培养一 （主要依癌细胞侵袭能力而定）。 较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。结果统计直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。取出 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 洗遍，甲醇固定分钟，将小室适当风干。结晶紫染色 ，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用 洗遍。倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。实验材料Transwellchamber:24-well,8.0-umporemembranes(Corning)细胞培养相关试剂：无血清培养基，10%血清培养基，PBS,0.02%EDTA固定液：甲醇染色液：Giemsa染液封片剂：中性树胶其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片操作步骤所有细胞培养试剂和Transwellchamber放在37°C温育；待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2X105/ml；在下室(即24孔板底部)加入600—800口l含10%血清的培养基，上室加入100—150口l细胞悬液，继续在孵箱培养24小时；用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800口l甲醇的孔中，室温固定30分钟；取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800ulGiemsa染液的孔中，室温染色15—30分钟；轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。\I■■ i[i*—r-*-.rf注意事项根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-um孔径(如AGS细胞)，如果细胞体积较大可以考虑用10-um孔径；根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-wellchamber接种细胞数约为2心5X104/well迁移时间12^36小时；由于Corning公司的24-Transwel内含12个独立的chamber为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一舞孔普通培养板Corning；如果细胞迁移能力较弱下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50ug/mlFN(Fibronecti)具体可查阅相关文献；细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；Chamber和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。细胞侵袭实验(cellinvasionassay)实验材料Matrigel(BD5mg/ml),-20°C保存其余材料同迁移实验操作步骤Matrigel在4C过夜融化；用4C预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度lmg/ml，冰上操作；在chamber上室底部中央垂直加入100口l稀释后的Matrigel,37C温育4－5小时使其干成胶状；后续步骤同迁移实验(1-8)。\I■■ \ 『—r-*-.rf注意事项Matrigel在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在4C预冷；铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡；其他注意事项同迁移试验。其他做肿瘤侵袭实验的具体步骤基质胶准备：将冻存于一度冰箱的 度过夜(),变成液态；()取无血清培养基，加入(或每室) ，混匀，(C操作,最好在冰浴上)，加入上室各 (个室)；放入C培养箱中，孵育()；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。注释：无血清培养基和基质胶按：稀释，每孔加，在C培养箱中 。()消化细胞，无血清培养基洗次，计数，配成细胞悬液；()用无血清培养基洗洗次；每孔加入细胞悬液；()下腔室中加入 含有%条件培养基；()C培养箱中，孵育()取出 用 洗遍,戊二醛固定，C；()加入结晶紫( )染色或染色(一)，室温 ，洗遍,用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。迁移实验

在孔板中浸泡小时；消化细胞，无血清培养基洗次，计数，配成细胞悬液，每孔加入 细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子；°。培养箱中，孵育 ；取出 用洗遍， 戊二醛固定，°C； 洗遍，加入结晶紫（ ）染色，室温，洗遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察计数 照相，记录。侵袭实验取 无血清培养基，加入（或 每室） ，混匀，（C操作，最好在冰浴上），加入上室各 （ 个室）；放入C培养箱中，孵育（ ）；消化细胞，无血清培养基洗次，计数，配成细胞悬液；用无血清培养基洗 洗次；每孔加入 细胞悬液；下腔室中加入 无血清条件培养基； C培养箱中，孵育 ；取出 用洗遍，戊二醛固定，C