第一章 酶学与酶工程 (2~5节)

EnzymeEngineering

酶工程第一章酶学与酶工程

第一节酶工程概述第二节酶的分类、组成、结构特点和作用机制第三节酶作为催化剂的显著特点第四节酶促反应动力学第五节酶的抑制作用第二节酶的分类、组成、结构特点和作用机制一．酶的分类：二．酶的组成和结构特点三．酶的作用机制（一）习惯命名法

1961年以前使用的酶的名称都是习惯沿用的，称为习惯名。主要依据以下原则：1.根据酶作用的底物命名，如纤维素酶。2.根据酶催化反应的性质及类型命名，如溶菌酶。3.根据酶的来源命名，如胰蛋白酶。有的酶结合上述原则来命名。习惯命名比较简单，应用历史较长，尽管缺乏系统性，但现在还被人们使用。一．酶的分类（二）国际系统命名法国际系统命名法原则是以酶的整体反应为基础的，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起反应，应在它们系统名称中包括两个底物的名称，并以“：”号将它们隔开。若底物之一是水时，可将水略去不写。

ATP＋D-葡萄糖ADP＋D-葡萄糖-6-磷酸国际系统命名为：ATP：D-葡萄糖磷酸转移酶（三）国际系统分类法及酶的编号

国际酶学委员会，根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别用1、2、3、4、5、6来表示。再根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分为若干个亚类，每一个亚类又按顺序编成1、2、3、4……等数字。每一个亚类可再分为亚亚类，仍用1、2、3、4……编号。每一个酶的分类编号由4个数字组成，数字间由“·”隔开，编号之前冠以EC（EnzymeCommision)。1．氧化还原酶2．转移酶3．水解酶4．裂合酶5．异构酶6．连接酶（合成酶）7．核酸酶（催化核酸）1．氧化还原酶(Oxidoreductase)包括脱氢酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等2．转移酶(Transferase)包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等3．水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶4．裂合酶(Lyase)这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。5．异构酶(Isomerase)此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等6．连接酶（合成酶）(LigaseorSynthetase)这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。

7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。酶用于生物催化的概况类别占总酶比例%利用率%水解酶hydrolases2665氧化还原酶oxidoreductases2725转移酶transferases245裂合酶lyases12~5异构酶isomerases5~1连接酶ligases6~1二．酶的组成和结构特点（一）酶的组成酶单纯酶结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子辅因子辅酶与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。（二）单体酶、寡聚酶和多酶复合物1.单体酶（monomericenzyme)：一般由一条多肽链组成，但有的单体酶是由多条肽链组成，肽链间二硫键相连构成一整体。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。3.多酶复合物(multienzymesystem)：是由几种酶非共价键彼此嵌合而成。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。(三)

活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质三．酶的作用机制1．酶的作用过程2．酶与底物的结合模型3．酶的催化作用1．酶的作用过程酶的活性部位：是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。2．酶与底物的结合模型a．锁和钥匙模型b．诱导锲合模型a．锁和钥匙模型

认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样b．诱导锲合模型

该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.3．酶的催化作用（1）研究方法（2）影响酶的催化作用（1）研究方法a.从非酶系统模式获得催化作用规律b.从酶的结构与功能研究中得到催化作用机理的证据。（2）影响酶的催化作用a.广义的酸碱催化b.共价催化c.邻近效应及定向效应d.变形或张力e.酶的活性中心为疏水区域a.广义的酸碱催化能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱例HA=A-+H+HA为酸，A-为碱例HA（酸）+X=AXH（酸催化）AXH+B-（碱）=Y+BH+A-（碱催化）b.共价催化底物与酶以共价方式形成中间物。这种中间物可以很快转变为活化能大为降低的转变态，从而提高催化反应速度b.共价催化亲电试剂：一种试剂具有强烈亲和电子的原子中心。亲核试剂：就是一种试剂具有强烈供给电子的原子中心。c.邻近效应及定向效应所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，其反应速度越快。d.变形或张力e.酶的活性中心为疏水区域酶的活性中心为酶分子的凹穴此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基第三节酶作为催化剂的显著特点一．催化能力二．专一性三.调节性一．催化能力催化常数kcat

（或转换数，TN）：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。一般为103min-1，碳酸酐酶最高为3.6*107min-1有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-1013二．专一性1．绝对专一：只催化一种底物进行快速反应，甚至是立体专一性2相对专一性：基团专一和键专一三.调节性1.酶浓度的调节2激素调节3.共价修饰调节4.限制性蛋白水解作用与酶活力调控5.抑制剂的调节6.反馈调节7.金属离子和其他小分子化合物的调节第四节酶促反应动力学

酶促反应动力学（kineticsofenzyme-catalyzedreactions）是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。酶促反应动力学的研究既有重要的理论意义，又具有一定的实践意义。一、底物浓度对酶反应速度的影响（一）中间络合物学说

1903年Henri用蔗糖酶水解做实验，研究底物浓度与反应速率的关系。当酶浓度不变时，可以测出一系列不同底物浓度下的反应速度，以反应速度对底物浓度作图，可得一双曲线。从该曲线可以看出，当底物浓度较低时，反应速率对底物浓度的关系呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的增加，反应速率不再按正比升高，反应表现为混合级反应。当底物浓度达到相当高时，底物浓度对反应速率影响变小几乎无关，反应达最大速率，为零级反应。

根据上述实验结果，Henri和Wurtz提出酶底物中间络合学说。（二）酶促反应的动力学方程式1.米氏公式的推导

1913年Michaelis和Menten在前人工作的基础上，根据酶反应的中间复合物学说，推导出底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，称之为米氏方程：Vmax[S]Ks+[S]V0=

1925年Briggs和Haldane提出了稳态学说，对米氏方程作了修正，认为酶促反应分为两步进行：（1）酶与底物作用形成酶-底物复合物（ES）；（2）ES复合物分解形成产物，释放出游离酶。他们认为，许多酶催化反应的k2很高，k2不仅不特小于k－1，而且远比k－1大，即ES分解成E和P的速度比解离成E和S的速度快。该学说认为，在反应进行了一段很短的时间后，[ES]由0增加到一定数值，然后保持不变，即达到稳态水平，这时生成ES的速度与ES分解和解离的速度相等。Theterm(k2+k-1)/k1isdefinedastheMichaelis-Mentenconstant,Km.

AnimportantnumericalrelationshipemergesfromtheMichaelisMentenequationinthespecialcasewhenV0isexactlyone-halfVmax。If[S]<<Km,2.动力学参数的意义（1）米氏常数的意义①Km是酶的一个特征常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但必须固定在某一反应条件下（pH、温度、离子强度等）才能保持不变。若一个酶可以催化多种底物反应，则对不同底物有不同的Km值。②Km值可以判断酶的专一性和天然底物，1/Km可近似地表示酶对底物亲和力的大小。③Km与Ks：Km=k-1+k2/k1，Ks=k-1/k1④若已知某酶的Km值，就可以计算在某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。⑤Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。（2）Vmax和k2（kcat）的意义在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一常数。Vmax与Km相似，同一种酶对不同底物的Vmax也不同，pH、温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值。（3）kcat/Km的意义

亦称为表观二级常数，酶的专一性常数

Kcat/Km值的大小，可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。比较竞争底物的专一性，根据kcat/Km值而不是Km值。对于一个酶促反应而言，当kcat/Km值达到108

～109S-1M-1

时，限速步骤在于酶与底物结合中的分子扩散，达到了极限。3.米氏常数的测定（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法（TheDouhle-ReciprocalPlot）横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax。（2）Eadie-Hofstee作图法

v=Vmax-Km·v/[S]以v~v/[S]作图得一直线，其纵轴截距为Vmax，斜率为-Km。（3）Hanes-Woolf作图法

[S]/v=[S]/Vmax+Km/Vmax以[S]/v~[S]作图得一直线，横轴截距为-Km，斜率为1/Vmax。

第五节酶的抑制作用

酶是蛋白质，凡可使蛋白质变性而引起酶活力丧失的作用为失活作用（inactivation)。由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失称为抑制作用（inhibition）。引起抑制作用的物质称为抑制剂（inhibitor）。变性剂对酶的变性无选择性，而一种抑制剂只能使一种酶或一类酶产生抑制作用，即抑制剂对酶的抑制作用是具有选择性的。一、抑制作用的类型根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类：1.不可逆的抑制作用（irreversibleinhibition）抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活者，称为不可逆抑制作用。2.可逆的抑制作用（reversibleinhibition）抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。

根据可逆抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分为以下类型：（1）竞争性抑制（competitiveinhibition）（2）非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）（3）反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）（4）其他可逆抑制二、可逆抑制作用动力学（一）竞争性抑制抑制剂（I）和底物（S）竞争酶的结合部位，从而影响了底物与酶的正常结合。竟争性抑制（二）非竞争性抑制底物与抑制剂同时和酶结合，两者没有竞争作用。非竞争性抑制（三）反竞争性抑制酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合，即ES+IESI，ESIPNoncompetitiveinhibitiona=1+[I]/KIcompetitive

inhibitionUncompetitiveinhibitiona’=1+[I]/K’I,K’I=[ES][I]/[ESI]noncompetitive

inhibition（四）其他可逆抑制

1．底物抑制2．产物抑制1．底物抑制

底物抑制：当底物过量时，反而可能减慢反应速度。其作用机制可能是：当两个底物分子同时向一酶分子攻击时，为了使自己能更接近活性中心，他们只能各自以一端与酶分子结合，这样反而阻碍了他们中的任一个与酶的正确结合。2．产物抑制

产物抑制：产物对酶反应的抑制作用在生物体中较为常见，在细胞内，酶反应的产物虽然不断被另外的酶作用，但S和P总是同时存在的，因此，考虑产物对反应速度的影响，可能具有一定的意义。三、一些重要的抑制剂1.不可逆抑制剂按照不可逆抑制作用的选择性，可将其分为两类：（1）非专一性不可逆抑制剂主要有以下几种：①有机磷化合物常见的有DIFP、农药敌敌畏、敌百虫、对硫磷等。②有机汞、有机砷化合物这类化合物与酶分子中半胱氨酸残基的硫基作用，抑制含硫基的酶。③重金属盐含Ag+、Cu2+、

Hg2+、

Pb2+

、

Fe3+重金属盐在高浓度时，能使酶蛋白变性失活。