第二章 基因工程制药

第二章基因工程制药

河南科技大学医学院药学系概念：基因工程药物指利用基因工程技术研制和生产的药物，包括重组蛋白多肽药物、反义核酸药物、DNA药物、基因工程抗体等。第一节概述蛋白细胞因子药物蛋白类激素溶血栓药物治疗用酶可溶性受体和黏附分子其它核酸DNA药物反义RNA药物RNAi药物核酶20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足。胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息基因工程大事记基因工程药物研究简史1976年第一家利用重组技术研制新药的公司—-Genetech1982年美英批准第一个基因工程药物——重组人胰岛素[美]Lilly公司受让获得生产权至2004年底FDA共批准79种大肠杆菌（18种）2000－2004只批了4种酵母（8种）2000－2004只批了2种哺乳动物细胞（53种）2000－2004批了22种基因工程药物的几次发展重组蛋白多肽类单克隆抗体药物基因组药物MPIF－1KGF2VEGF2在人类基因组计划与后基因组基础上开发新药是研发新型基因工程药物的新模式药物靶标：现有500药靶，其中45％为膜受体、28％是酶、其余为激素、离子通道、核受体和DNA，7％未知.HGP增加药靶数量：3－4万基因，可能药靶3000以上；探寻具治疗作用的新基因备用基因工程药物我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。α1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年

通过Ⅲ

期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。基因工程药物制药的主要程序:⒈目的基因的克隆，⒉构建DAN重组体，⒊DAN重组体转入宿主菌，⒋构建工程菌，⒌工程菌发酵，⒍表达产物的分离纯化，⒎产品的检验等包含三个步骤获得目的基因组建重组质粒构建工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装基因工程基本过程：建立基因高效表达系统

微生物表达系统1动物细胞表达系统2动物活体表达系统3植物表达系统41、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。在实验室完成。：“切、接、转、增、检”五步）2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”）；（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）；（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）；（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称“增”）；（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）；基因工程关键要素工具酶与载体系统目的基因的获得基因的重组与转移克隆基因导入宿主细胞表达第二节基因工程的工具酶与载体一、工具酶常用的工具酶：（一）限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。关于限制性内切酶来源：性质：功能：自我保护，细菌的限制与修饰系统。1、限制性内切酶的来源与性质寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。R/M体系：是由两种酶活性配合完成的：一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶

R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。

※EcoB的核酸酶不能识别已甲基化的序列。TGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶TGAN8TGCTACTN8ACGACH3CH3CH3CH3甲基化酶噬菌体来源序列宿主来源序列※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。※

1968年，阿尔伯证明了一种特别的限制酶的存在，它只分裂那些含有为噬菌体所特有的某种序列的核苷酸；※这一工作经过内森斯和史密斯的发展，从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII。※限制性核酸酶的发现，为基因结构、DNA碱基顺序分析和基因工程的研究开辟了途径。2023/2/328阿尔伯WernerArber瑞士巴塞尔Biozentrum大学史密斯HamiltonO.Smith美国霍普金斯大学医学院内森斯DanielNathans美国霍普金斯大学医学院W.阿尔伯，H.史密斯和D.内森斯三人共同获得了1978年诺贝尔奖2、限制性内切酶的功能限制功能：外源DNA的切割功能修饰功能：自身DNA的甲基化3、限制性核酸内切酶的命名若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。

4、限制性核酸内切酶的活性单位50ul反应体系中，含1ug底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。所以一般使用专一的反应缓冲液。5、缓冲液(Buffer)是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。缓冲液的化学组成:MgCl2

、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；6、温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37℃，少数要求40-65℃。7、限制性核酸内切酶的分类根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶II类限制性内切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ基本特点：Ⅰ.识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（通常是由4～8个核苷酸组成的回文序列）。与DNA的来源无关。2023/2/337Ⅱ.切割位点在识别位点处切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端分两种类型：①3’端凸出（如PstI切点）；②5’端凸出（如EcoRI切点）粘性末端的意义:①连接便利与平齐末端相比，粘性末端的连接效率更高。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。同裂酶（Isoschizomers)识别位点的序列相同的限制性内切酶。Ⅰ.完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuIⅡ.不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如XmaI和Sma同尾酶（Isocaudamers)8、限制性内切酶对DNA的消化内切酶与识别序列的结合模式1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。完全消化内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开局部消化只有有限数量的酶切位点被切开9、限制酶酶切反应的终止大多数酶可用65℃温育5min失活。10、几种常用限制酶识别位点11、限制性核酸内切酶的应用重组DNA前的切割构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究（二）DNA连接酶（ligase）能够催化DNA中相邻的3’-羟基和5’-磷酸基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键。T4DNA连接酶可连接带匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。大肠杆菌DNA连接酶只能连接带匹配粘性末端的DNA分子(a)分子间连接连接条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+连接反应的机理连接反应的温度连接酶反应的最佳温度37℃。但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用14～16℃。影响连接反应的因素插入片段与载体的浓度比例：10~20倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。2.反应温度：一般14~16℃（三）DNA聚合酶把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)

Klenow片段(E.coli)T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli)

T７DNA聚合酶(T７Phage感染的E.coli)修饰的T７DNA聚合酶(测序酶)TaqDNA聚合酶(耐热)DNA末端转移酶(不依赖DNA)

反转录酶(依赖RNA)聚合酶主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。大多数DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。常用DNA聚合酶的特性比较化学发光底物：HRPO和AP的显色反应底物克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。柯斯质粒(cosmid)一种人工构建的克隆载体，包含了λ噬菌体的cos基因。柯斯质粒能被包装到λ噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大。其他酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）人基因组十分庞大，约含3×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要工具。正常酵母人工染色体含有：四膜虫端粒（tel)酵母自主复制序列（ARS)酵母着丝点(CEN)酵母的选择标记(TRP1、URA3)YAC载体第三节基因工程目的基因的制备与重组一、目的基因制备方法1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(PCR)1.化学合成法获取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。一般用于小分子基因的合成2.从基因组DNA文库获取目的基因基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库3.从cDNA文库获取目的基因(逆转录法)cDNA文库(cDNAlibrary)：以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNAlibrary)。C-文库具有组织细胞特异性。获取途径：mRNApurificationa.细胞内RNA的组成和含量:DNA：95%核内，5％细胞器RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器rRNA80-85%；tRNA10-15%；mRNA1-5%b.真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法。3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)纤维素柱纯化Poly(A)mRNA流程图Oligo(dT)纤维素Poly(A)--Oligo(dT)cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。cDNA第二链的合成：cDNA第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接合成法cDNAcloning：expressionvectorpUC将重组体导入hostcellcDNAlibraryidentification目的cDNA克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、转录起始点等。）4.利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。二、目的基因的重组DNA重组技术，即含有目的基因的DNA片段和载体DNA连接技术。本质：DNA片段之间的体外连接核心步骤：涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程。载体的选择质粒：可用于细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。噬菌体：经构建后，常用于细菌细胞。病毒：常用作动物细胞基因工程的载体。DNA分子的体外切割与连接目的基因连接到载体上去，要经过一系列酶促反应，需要几种工具酶，这中间最为重要的是两大类酶：①DNA限制性内切酶：把载体DNA片段切开。②DNA连接酶：用于连接载体和外源DNA片段。此外，在构建DNA重组分子中使用的工具酶还有：DNA聚合酶、逆转录酶、DNA修饰酶、RNA修饰酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等。DNA分子的体外连接

粘性末端连接：连接效率高具有匹配的酶切末端平端连接：连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法以相同的限制性内切酶酶切，产生匹配的末端三、将重组DNA导入宿主细胞重组体DNA分子只有导入合适的受体细胞，才能进行大量地复制，扩增和表达。感受态细胞的制备连接产物的转化基因工程菌TOP10，DH5α，BL21，JM109转化(transformation)制备感受态细胞：冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infection)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。四、目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation)：抗药性标志选择标志补救：表达产物与营养缺陷互补α-互补、蓝白斑筛选免疫学方法：Westernblot、抗体杂交分子杂交：探针原位杂交PCR限制性酶切图谱五、目的基因的表达克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高效的表达该基因，从而获得大量的、市场原本难以获得的药物。原核表达系统常用的宿主细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；真核表达系统常用的宿主细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。（一）原核表达体系原核表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记（3）具有很强的启动子（4）具有阻遏子（5）有很强的终止子（6）有翻译的起始信号常用的表达载体：（1）pBV220系统（2）pET系统

外源基因在原核表达系统中表达的必要条件(1).删除内含子和5’非编码区；(2).外源基因置于强启动子和SD序列控制下；(3).维持正确的开放阅读框（ORF）(4).mRNA稳定且可以有效转译，形成的蛋白质不易被降解影响基因在原核细胞中表达效率的因素：1.启动子：建立表达载体的时候，选择强启动子常见的原核强启动子：(1)Plac:受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导；(2)Ptrp:取自大肠杆菌色氨酸操纵子；(3)Ptac:Lac启动子和trp启动子的杂合启动子；(4)PL和PR:噬菌体早期左/右启动子，受λ噬菌体CI基因负调控，温度诱导(5)T7启动子2.基因剂量:带目的基因载体的拷贝数。3.核糖体结合位点(1)SD顺序与16srRNA3’末端互补程度：UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的SD序列能使蛋白质的产量提高36倍(2)ATG（AUG)—SD间的距离：5-13bp4.密码子的选用不同生物甚至同种生物的不同蛋白质的基因，对简并密码子的使用具有一定的选择性。原核表达载体的类型：(1)融合型表达载体——表达出融合蛋白；(2)非融合型表达载体——表达出完整蛋白；(3)分泌型表达载体——表达产物可跨膜分泌到胞间隙。融合型表达载体非融合型表达载体分泌型表达载体常见的表达受体菌株原核表达的宿主细胞（1）大肠杆菌：表达产物的形式和种类广泛（细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达）。大肠杆菌表达体系的不足

缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性

很难表达大量的可溶性蛋白此外，由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。（2）枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包涵体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。（3）链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。外源基因在原核细胞中表达产物的检测鉴定（二）真核表达体系不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较真核基因表达外源基因的意义(一)生产基因工程产品－有生物活性的蛋白质，尤其是药物。(二)研究基因功能，观察目的基因－产物：1.对细胞生理活动的影响：如细胞增殖、分化、基因表达及其他特殊功能等；2.活性结构域：如突变目的基因－>导入细胞，可阐明表达产物关键结构区和关键点；3.结构分析：如制备过量的目的蛋白用于结构分析。典型的真核细胞表达载体需要以下顺式作用元件:(1)启动子/增强子(2)终止信号和加多聚腺苷酸化信号，(3)选择标记(4)几个原核作用元件，如细菌抗生素选择标记(Ampr)和用于质粒扩增的复制子（具有原核作用元件才能作为原核细胞和真核细胞之间的穿梭质粒）等。真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止信号和加poly(A)信号真核表达的宿主细胞（1）酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。（2）丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。（3）哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。外源基因导入真核细胞的基本方法近年来，基因导入方法不断改进，使得转染效率逐渐接近100％，将外源基因导入真核细胞的方法有2类。病毒感染（Virusinfection）：是一种将外源基因导入细胞的天然方法。质粒转染（Transfection）：用非病毒的理化方法将外源基因导入真核细胞的方法称转染。外源基因在真核细胞中表达的主要方式（一）按外源基因在真核细胞中表达时间的长短：（二）按外源基因在真核细胞中表达方式的不同：1.分泌表达2.非分泌表达3.融合表达4.非融合表达（三）克服外源基因对宿主细胞的毒性建立可调控的诱导型表达载体，给一定浓度的诱导药物，可避免外源基因产物的毒性，建立稳定的转染细胞株。如四环素诱导表达系统和蜕皮素(Pnasterone)诱导表达系统外源基因在真核细胞中表达产物的鉴定和纯化虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。药物筛选转染细胞来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因）潮霉素B磷酸转移酶（HPH）胸苷激酶（TK）反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。新霉素G418：细菌抗生素，干扰原核、真核生物蛋白质合成

neo（APH）：磷酸转移酶新霉素抗性基因(neo)能在真核细胞中表达并能使G418失活(neo基因编码一个磷酸转移酶),细胞可以生长.neo与目的基因连锁,转染Question?分析三大表达系统在基因工程制药应用中的优缺点？试统计分析FDA批准的三种表达系统生产的全部药物？第四节基因工程菌的稳定性基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。第五节基因工程菌生长代谢的特点

对菌体生长的调控主要有两种观点：一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；另一种认为是小分子前体和催化组分等等的限制决定了菌体的最大比生长速率。菌体生长与能量的关系当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。产生乙酸的机制还不完全清楚，一般认为是由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化为乙酸来供能。高浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。菌体生长与前体供应的关系由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子和合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。“严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，合并称为“魔点”的ppGpp的结果。第六节基因工程菌发酵一、基因工程菌的培养过程：（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件：如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。二、基因工程菌的培养方式常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。1、补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。2、连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。3、透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。4、固定化培养三、基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1）生物材料方面（2）生产目的方面1、培养基的影响常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。培养基及灌注式细胞培养袋

2、接种量的影响接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。3、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。4、溶解氧的影响溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。5、诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。6、pH的影响pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。四、基因工程菌的培养设备发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。第七节基因工程药物的分离纯化许多医药生物技术产品都是活性肽或蛋白质。这些产品的制备具有下列特点：（1）目的产物在初始物料中含量较低（2）含目的产物的初始物料组成复杂，且影响较大（3）目的产物的稳定性差（4）种类繁多（5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。一、建立分离纯化工艺的依据1、含目的产物的起始物料的特点：包括（1）菌种类型及其代谢特性（2）原材料和培养基的来源及其质量（3）生产工艺和条件（4）初始物料的物理、化学和生物学特性。2、物料中杂质的种类和性质3、目的产物特性4、产品质量的要求二、分离纯化的基本过程分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。

重组蛋白表达及分离纯化技术平台基因工程药物分离纯化生产装置

三、分离纯化的技术分离纯化技术应满足下列要求：（1）技术条件要温和（2）选择性要好（3）收率要高（4）两个技术之间要能直接衔接（5）整个分离纯化过程要快1、细胞破碎与固液分离：有细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。（1）细胞收集：细胞收集常用的是离心分离的方法，膜过滤法液逐步得到广泛应用。（2）细胞破碎：有机械破碎法和非机械破碎法。机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。（3）固液分离：离心沉淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。2、目的产物的分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱。亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性，他们对分离纯化的影响见表3—3。选择纯化方法应根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。（1）离子交换色谱（ionexchangechromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。

（2）反相色谱（reversedphasechromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography,HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。（3）亲和色谱（affinitychromatography,AC）亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。（4）凝胶过滤色谱凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小