第一章基因工程概述

基因工程原理与技术考核方法平时成绩30%闭卷考试70%名词解释出勤课堂课堂表现作业填空题选择题100%判断题问答题主要参考资料王关林等.植物基因工程.科学出版社。吴乃虎等.基因工程原理.科学出版社。•生物技术通报•中国生物工程杂志•农业生物技术学报•生物工程学报•生物技术•遗传•Moleculargeneticsandgenomics

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Nature《基因工程原理与技术》第一章基因工程概述第二章基因工程的载体和工具酶第三章基因的常规技术第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达第五章转基因植物第六章转基因动物（自修）第七章基因治疗（选讲、自修）第一章绪论——基因工程概述第一节基因工程概念第二节基因工程的诞生和发展第三节基因工程的研究内容第四节基因工程的成就和前景展望第一节基因工程概念一、基因工程的概念在分子水平上，提取或合成不同生物的遗传物质，在体外进行切割、再和某一载体进行拼接重组，然后再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。简单说：指异源重组DNA在受体细胞的扩增与表达。

DNA重组、扩增、表达是其三要素。生物工程biologicalengineering遗传工程geneticengineering基因工程geneengineering分子克隆molecularcloning基因克隆genecloning基因操作genemanipulation重组DNA技术recombinantDNAtechnique二、基因工程的概念比较基因工程(geneengineering)常和以下名称混用:基因工程与遗传工程区别与联系：

遗传工程（GeneticEngineering)指人工改造物种遗传性的技术。包括：基因工程、蛋白质工程——分子水平染色体倍性、染色体代换——染色体水平细胞融合、花粉培育——细胞水平理化诱变、有性杂交、常规育种——个体水平

因此遗传工程比基因工程有更广泛的内容，遗传工程包括基因工程，但基因工程不等于遗传工程。基因工程与生物工程区别与联系：生物工程(Bioengineering):指以现代生命科学为基础，结合先进的生物工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先设计改造生物体或加工生物原料为人类生产所学的产品技术。因此，生物工程是新兴的综合性学科，是现代生物学产生的一切工程技术的总称，包括：基因工程遗传工程细胞工程(Cellengineering)

发酵工程(Fermentationengineering)

酶工程(Enzymesengineering)

食品工程(Foolsengineering)

生化工程(Biochemistryengineering)组织工程（Tissueengineering）克隆（Clone）原意指从一个共同祖先繁殖下来的一群遗传上同一的细胞或个体所组成的细胞或个体的群体（相当于我们每个人熟知的拷贝copy）。基因工程是异源重组DNA的扩增与表达故亦称分子克隆（molecularcloning）。“克隆羊”即是拷贝羊、复制羊“克隆人”即是拷贝人、复制人基因工程与分子克隆的联系：上游技术：重组DNA的设计（原概念含义）；

下游技术：重组DNA的产业化与应用包括DNA重组产物的分离纯化、工厂化,生产的工艺与设备、应用，环保的安全、管理、措施、法规，已单列一门课研究。基因工程与上、下游技术的关系：目前基因工程技术已产业化，基因工程概念升华为重组DNA的设计及产业化应用。区分为：第二节基因工程的诞生和发展一、基因泛基因阶段1

顺反子阶段4

摩尔根的基因阶段3

孟德尔遗传因子阶段2

现代基因阶段

5基因的研究MendelG.J.(1822-1884).1856-1864豌豆杂交实验。2Mendel的遗传因子阶段1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。遗传因子是决定性状的抽象符号。1909年丹麦遗传学家Yohannsen(1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遗传因子”的概念。但没有提出基因的物质概念。3Morgan的基因阶段1910年以后，MorganT.H.等提出了基因的连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。连锁遗传规律的提出4顺反子阶段1957年，本泽尔（SeymourBenzer）以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念。

顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。5.现代基因阶段

1）操纵子

（启动基因＋操纵基因＋结构基因）2）跳跃基因

指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。3）断裂基因

1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。4）假基因

不能合成出功能蛋白质的失活基因

。5）重叠基因

不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的即重叠的。现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

1973年是基因工程元年。（S.Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性的转化子菌落，在世界上第一次人工改造生物的遗传特性，创造新生命的成功。)理论上的三大发现和技术上的三大发明，对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。二、基因工程的诞生1944年，AveryO.T.利用肺炎双球菌转化实验三大理论：1、DNA是遗传物质被证实1944年，O.Avery和其同事作了一个实验，肺炎球菌有两种类型，一种是菌体细胞外包有多糖荚膜从而可以致病的类型，许多这样的细菌集结在一起形成的菌落是光滑的(smooth)，所以称作S型；另一类型不具荚膜也不致病，它的菌落是粗糙的（rough），称作R型。格列菲斯把加热杀死的S型与不能致病的R型细菌混和注入到小鼠体内，结果小鼠致病而死。将死鼠体内分离出的细菌进行体外培养，发现其中有大量的S型活菌。难道S型致病菌复活了吗？Watson和Crick2、DNA双螺旋模型的提出50年代，DNA的双螺旋模型的提出和DNA复制机理的阐明

DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。

1953年，FrancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。Nireberg等为代表的一批科学家3、“中心法则”和“操纵子学说”的提出60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）

既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。原核生物的基因调控操纵子模型1961年，JacquesMonod和FancoisJacob提出了原核基因调控的操纵子模型（operonmodel）。1970年Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，H.W.Boyer等相继发现了ＥcoRI一类重要的限制性内切酶。

三大技术：4、工具酶的发现和应用1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。4、工具酶的发现和应用

1969年，有人从美国黄石国家公园温泉中的水生栖热菌体内分离纯化出了耐热的DNA多聚酶，后来的商品名叫Taq酶。4、工具酶的发现和应用

1988年，西特斯公司的研究者们开始在PCR中使用Taq酶。这是PCR技术的重大改进，在此基础上实现了反应的自动化，从而PCR技术得到了极为广泛的应用。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA肿瘤病毒中各自发现了反转录酶，完善了中心法则，用于构建cDNA

文库。4、工具酶的发现和应用载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；5、载体的发现及其应用SV40λ噬菌体EcoRIEcoRIT4连接酶第一个重组分子6、重组子导入受体细胞技术1944年，肺炎链球菌被成功转化。1970年，大肠杆菌才被成功转化，得益于CaCl2的应用。1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。1973年被定为基因工程诞生的元年。基因工程诞生基因的研究曾经是一片被冷落的“处女地”，而基因工程的诞生使基因成为人们竞相研究和争夺的对象，基因就好比灰姑娘因为水晶鞋而突然变得光彩照人、身价百倍。基因工程——魔力水晶鞋第三节基因工程的研究内容一、基因工程研究的主要内容1.基础研究2.克隆载体的研究3.受体系统的研究4.目的基因的研究5.生物基因组学的研究二、基因工程研究的基本操作程序1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增。5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。例如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。第四节基因工程的成就和研究进展成就：在医药领域在农业领域在工业领域研究进展：主要讲中国的一、医药领域1977年，激素抑制素的发酵生产成功。Itakara等，化学合成的激素抑制素基因和大肠杆菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重组质粒，并通过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有生物活性的激素抑制素。首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，这相当于50万头羊脑的提取量，使SMT售价由5万美元/g降至300美元/g。

1978年，Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。1979年，Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。1980年，Nagata等，遗传工程菌生产干扰素获得成功。1981年，用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。1982年，重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。1983年，基因工程产狂犬病疫苗取得突破型进展。制药业的发展经历了：由外源基因→原核表达→酵母表达→动物表达：喝牛奶防癌；植物表达：吃香蕉治乙肝。碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生成素1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mg世界主要生物药品年销售额（亿美元）

EPO16.5

葡萄糖脑苷酯酶2.15抗CD3MAb

0.8人白细胞介素20.40凝血因子VIII2.5

α-干扰素7.00G-CSF9.36

β-干扰素2.55GM-CSF0.41

γ-干扰素0.04

tPA3.0

人生长激素4.50B型肝炎疫苗

10.0

人胰岛素7.00

中国基因工程制药200多家生物技术公司生物技术药品产值：1996-18亿元；1997-30亿元；2000-72亿元可生产药物品种：约20种‘83‘84‘85‘86‘87‘88‘89‘90‘91‘92‘93‘94‘95‘96‘97‘98‘99‘00‘01‘02FirsttransgenicplantDelay-ripeningtomatoCommercializedintheUSFirst

field

testsHerbicideresistant,insectresistantplantscommercializedGMmaizeapprovedbyEU

FirstBtcornplantsRottingresistanttomatoapprovedbyFDA植物基因工程的发展迅速二、农业领域植物转基因育种的发展优势1、扩大了作物育种的基因库

转基因育种打破了常规育种的物种界限，来源于动植物和微生物的有用基因都可以导入作物，培育成具有某些特殊性状的新型作物品种。2、提高了作物育种的效率

作物转基因育种不仅大大缩短育种年限，而且可成功地改良某些单一性状却不影响改良品种的原有优良特性。3、减轻了农业生产对环境的污染转基因抗虫棉花的大面积种植和推广，不仅可以减少化学杀虫剂对棉农及天敌

的伤害，而且可以大幅度降低用于购买农药和虫害防治的费用。另外，随着高效固氮转基因作物及高效吸收土壤中磷元素等营养元素的转基因作物不断问世和推广，农用化肥的利用率将极大地提高，这对减少农田污染具有重要意义。4、拓宽了作物生产的范畴各种有价值的蛋白产品都可以利用植物反应器进行高效生产，番茄、马铃薯、莴苣和香蕉等作物已被成功用于生产口服疫苗。另外，各种工业原料，比如纤维素、海藻糖和可降解塑料等也可以用植物来生产。有人甚至预言，除了钢筋混凝土之外，未来的转基因作物将可能生产出人类所需要的一切产品。全球转基因作物种植面积（百万公顷）全球转基因作物导入特性比例植物基因工程研究植物基因组计划植物分子育种高产、优质、高效和多抗性植物作为反应器香蕉、马铃薯、番茄等水稻、玉米、棉花、大豆、高粱和番茄酒精、石油、工业酶等※植物可成为一个制药厂：吃香蕉治乙肝，吃马铃薯治疗痢疾，吃番茄治疗癌症即将实现。烟草叶片胶囊可能是多种药物的制剂，烟草商可能不再担心“禁烟”带来的损失。※植物是一座化工厂：用油菜生产热带月桂树特产的月桂酸，使美国节省了因进口月桂酸而消耗的4亿美元。石油危机将可能找到解决新途径。这一切使农业种植结构发生巨变，亦将使制药业、化工业发