第10章外源基因表达与基因工程药物

外源基因表达与基因工程药物第十章目录第一节

概述

一、基因表达基本原理

基因表达指基因通过转录和翻译而产生其蛋白产物,或转录后直接产生其RNA产物的过程。外源基因表达利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成mRNA，进而翻译成肽链或加工成活性蛋白质的过程。基因工程（geneticengineering)为实现基因克隆所采用的方法和相关技术，包括重组DNA技术及操作过程，表达产物的后续处理过程和技术（如蛋白质分离纯化、修饰和加工技术、中试和扩大生产规模的工艺和技术等）统称为基因工程。生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）转录与翻译各有两种模式：原核生物与真核生物转录一、基因表达基本原理

原核生物真核生物转录全长转录，无需RNA加工无活性前体需剪辑、加工修饰后转变成具有翻译模板的活性形式翻译转录与翻译偶联，mRNA直接作模板指导肽链合成；可编码多条肽链转录与翻译分隔进行；编码一条肽链宿主细胞表达的外源蛋白的属性涉及：①目标蛋白是否是糖基化蛋白②真核生物蛋白三维结构的复杂程度二、基因表达基本类型

根据外源基因表达宿主细胞原核表达系统包括大肠杆菌、芽孢杆菌系统真核表达系统包括酵母、昆虫、哺乳动物细胞根据表达产物在宿主细胞的部位胞内表达：表达产物存在于胞质中定位表达：通过定位系统分布于周间质等特定位置分泌表达：通过分泌分泌到细胞外根据表达产物的溶解状态可溶性表达：溶解形式存在包涵体表达：以包涵体形式存在根据表达产物的结构状况非融合表达融合表达：N-端或C-端连接一个特定功能肽链第二节

外源基因表达基本过程

以质粒为载体的DNA

克隆过程重组DNA技术的发展史1865年

G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。一、目的基因的获取化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。RT-PCR扩增，从总RNA或mRNA反转录扩增PCR扩增从cDNA文库(cDNAlibrary)或基因组文库(genomicDNAlibrary)扩增杂交技术从cDNA文库或基因组文库筛选利用筛淘技术，从各类型文库中筛淘化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库mRNAcDNA

双链cDNA

重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT（一）载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，是实现目的基因在宿主细胞的复制、转录、翻译以及翻译后加工修饰的保障。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA二、目的基因与表达载体的重组载体的共同特征本身是复制子，能自主复制；分子量小，易于操作和易于得到完整分子具有选择性标记，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有一定的非必要区（即插入外源DNA不影响其复制的区段。表达载体具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列和增强子等调控元件多克隆位点ori复制起始区抗性基因或遗传标记Amppolylinker载体基本组成克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。1.质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。某些细胞中独立于染色体以外共价闭合环状的小分子双链DNA，它具有在宿主细胞内独立复制的能力，并可在宿主细胞分裂时随染色体一道分配到子细胞中。

λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)

细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)

动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他需要的工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶（二）重组重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：作用：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin

dⅢ属

系

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口

：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG呈二元旋转对称BamHⅠ切割位点：双链DNA的磷酸二酯键，产生5’-磷酸基，3’羟基末端切割长度：对于识别4个核苷酸的酶，每44长度出现一个靶顺序对于识别6个核苷酸的酶，每46长度出现一个靶顺序BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称异源同工酶或同裂酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ异源同工酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBg

lⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’Bgl

Ⅱ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:Apa

Ⅰ

5’…GGGCC▼C...3’Hae

Ⅱ

5’…PuGCGC▼Py...3’Kpn

Ⅰ

5’…GGTAC▼C...3’Pst

Ⅰ

5’…CTGCA▼G...3’Sph

Ⅰ

5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:Alu

Ⅰ

5’…AG▼CT...3’EcoR

Ⅴ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性内切核酸酶（三）外源基因与载体的连接方式：(1)同一限制酶切位点连接

(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接粘性末端连接工具酶：DNA连接酶催化形成3‘，5‘-磷酸二酯键，实现基因与载体的共价连接，即重组BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。平端连接

限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连宿主细胞条件：限制酶和重组酶缺陷易于重组子导入遗传稳定性好安全性高功能互补具有较好翻译后加工机制蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低

三、重组DNA导入宿主细胞及其筛选与确认导入方式：转导（transduction)转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)转导（Transduction）指噬菌体颗粒感染宿主细胞，通过特定的途径，将噬菌体核酸注入宿主细胞内的过程，并使噬菌体核酸在宿主细胞内实现复制、转录、翻译或子代噬菌体的繁殖。实质是：被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)转化（Transformation）指感受态细胞接纳外源DNA分子的过程，并使其在宿主细胞内实现复制、扩增、转录、翻译（统称表达）。实质是：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。方式有两种：二价金属离子如Ca2+、Mn2+处理电转化即电穿孔法如：细菌感受态制备、重组体转化及筛选细菌感受态细胞的制备：CaCl2

处理法

受体细菌0-4℃0.1MCaCl2冰浴15-30min细菌处于感受态42℃，细胞热休克细菌的细胞膜通透性增加重组DNA进入感受态细胞LB0.18M0.1MCaCl20.1MCaCl2H2O细胞膨胀：低渗环境胞膜收缩：低温环境离子扩散：DNA-Ca2＋热休克：42℃1LLB培养基:10g胰蛋白胨5g酵母提取物10gNaCl0.18M转化

1.根据表型特征或遗传标记筛选(1)

抗药性标记选择(2)蓝白筛选2.噬菌体的溶菌性和溶源性3.利用核酸探针筛选4.限制性内切核酸酶图谱筛选5.PCR筛选6.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（三）宿主细胞内重组子的筛选与确认(插入失活法)

抗药性标记选择

α互补利用α互补原理筛选重组体pUC18

原位杂交

Southern印迹鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法重组DNA技术操作过程可形象归纳为：

小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体

重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化四、目的基因表达通过：1.目的DNA的有效转录2.mRNA的有效翻译3.翻译后的加工修饰标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点

E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

；很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用)原核基因转录调控以操纵子模式进行原核生物蛋白质因子——操纵子(operon)

机制特异DNA序列编码序列

启动序列操纵序列

其他调节序列(promoter)(operator)操纵子模型的普遍性原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位──操纵子（operon）。一个操纵子只含一个启动序列（promoter）及数个可转录的编码基因。通常，这些编码基因可转录出多顺反子mRNA。原核基因的协调表达就是通过调控单个启动基因的活性来完成的。是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。1、启动序列RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp

tRNATyrlacrecAAra

BAD

TTGACA

TATAAT共有序列图13-1五种E.coli启动序列的共有序列2、操纵序列

——阻遏蛋白(repressor)的结合位点当操纵序列结合有阻遏蛋白时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻碍转录。启动序列编码序列操纵序列pol阻遏蛋白（一）乳糖操纵子(lac

operon)的结构

调控区CAP结合位点启动序列操纵序列

结构基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙酰基转移酶ZYAOPDNAmRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖存在时阻遏基因阻遏蛋白的负性调节mRNA阻遏蛋白有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶图13-4lac

操纵子与阻遏蛋白的负性调节原核生物mRNA作为模板进行翻译的效率与强度与SD序列的碱基排序和组成以及其与起始密码子ATG的间隔相关：在各种mRNA起始AUG上游约8～13核苷酸部位，存在一段由4～9个核苷酸组成的一致序列，富含嘌呤碱基，如-AGGAGG-，称为Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又称核蛋白体结合位点(ribosomalbindingsite,RBS)。一条多顺反子mRNA序列上的每个基因编码序列均拥有各自的S-D序列和起始AUG。S-D序列小亚基中的16S-rRNA3ˊ-端有一富含嘧啶碱基的短序列，如-UCCUCC-，通过与S-D序列碱基互补而使mRNA与小亚基结合。mRNA序列上紧接S-D序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别并结合。大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA

可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染

DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核基因顺式作用元件影响基因转录活性启动子真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。TATA盒GC盒CAAT盒CCAAT盒GC盒TATA盒转录起始点高等真核生物上游激活序列（UAS）TATA盒转录起始点酵母图13-7真核基因启动子的典型结构增强子(enhancer)指远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性、增强启动子转录活性的DNA序列。其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。沉默子(silencer)某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。新生多肽链不具备蛋白质的生物学活性，必须经过复杂的加工过程才能转变为具有天然构象的功能蛋白质，这一加工过程称为翻译后修饰(posttranslationalmodification)。翻译后修饰包括多肽链折叠为天然的三维构象及对肽链一级结构的修饰、空间结构的修饰等。翻译后修饰使得蛋白质组成更加多样化，从而使蛋白质结构上呈现更大的复杂性。多肽链折叠为天然构象的蛋白质新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N-端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶和蛋白质辅助。蛋白质一级结构修饰主要是肽键水解和化学修饰

（一）肽链末端的修饰（二）个别氨基酸的共价修饰1．糖基化2．羟基化3．甲基化4．磷酸化5．二硫键形成6．亲脂性修饰例：鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰多肽链的水解修饰空间结构的修饰结合蛋白质合成后都需要结合相应辅基，才能成为具有功能活性的天然蛋白质。具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体(oligomer)。（一）通过非共价键亚基聚合形成具有四级结构的蛋白质（二）辅基连接后形成完整的结合蛋白质合成后蛋白质可被靶向输送至细胞特定部位蛋白质在核蛋白体上合成后，必须分选出来，定向输送到一个合适的部位才能行使各自的生物学功能。蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要是N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这类