第五章分子发光0604

第五章分子发光分析法★分子发光分析法：根据分子发光现象建立起来的一类分析方法。★分子发光光致发光热致发光场致发光化学发光分子荧光分子磷光★本章讨论分子荧光、分子磷光和化学发光分析法第一节荧光分析法一、概述★分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。★缺点：应用不如吸光光度法广泛。★优点比吸光光度法灵敏度高，检测限低；比吸光光度法选择性好。二、基本原理（一）分子荧光的产生

在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发到激发态。激发态是很不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。如果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理。每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。1.分子能级★基态：分子的能量最低，最稳定的能级(S0)★激发态：相对基态，能量较高的能级。能量从低到高依次叫作第一激发态(S1

、

T1)、第二激发态(S1

、

T1)…★荧光和磷光的产生只与成键电子的Ee的变化有关。分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，每个电子能级还包含有多重态，多重态的个数用M=2S+1计算，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。2.分子中电子能级的多重态★单重态（S）：若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0,M=1该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。★三重态（T）：分子中具有两个自旋不配对的电子，即S=1,M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。

★在通常条件下，大多数有机分子处于基态。成键的两个电子以自旋方向相反方式（保里不相容原理）占据成键分子轨道，即处于基态单重态；★根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定，三重态能级比相应单重态能量低；3.分子中电子能级的跃迁当物质受紫外-可见光照射时，基态分子选择性吸收光能，使处于成键分子轨道中的两个自旋方向相反的电子之一发生激发跃迁，进入相应的反键分子轨道而处于第一、第二电子激发单重态S1、S2的不同振动能级上。★电子不论跃迁到哪一个能级上，激发跃迁都是一步到位。★由S0到T1跃迁须改变电子自旋方向，属于禁阻跃迁。4.激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁(1)振动弛豫：同一电子能级内，分子以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。(2)内转换：同多重度电子能级中,电子由高能级向低能级的无辐跃迁。内部转移的时间为10－11S～10－13S数量级。

振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动能级。(3)荧光发射：处于激发单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(v=0)后，以辐射的形式跃迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射，发射的荧光波长为。

电于经过振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长，即。第一发单重态最低振动能级的平均寿命得为10－9～10－4S，因此荧光寿命也在这一数量级。(4)系间跨跃

：不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选择)，但如果两个能态的能层有较大重叠时，就有可能通过自旋一轨道偶合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速度很小，经历的时间较长。(5)磷光发射：激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为10－4～100S。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即。

(6)外部转移：激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为猝灭或熄灭。（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率激发态分子的去激发包括两种过程，即无辐射跃迁过程和辐射跃迁过程，辐射跃迁可发射荧光或磷光。而有多少比例的激发分子发射出荧光(或磷光)呢。可以用荧光量子产率ΦF--有时也叫也叫荧光效率或荧光产率(或磷光量子产率φP)表示。φF定义为：荧光物质吸光后所发射荧光的光量子数与所吸光的光量子数之比，即:许多吸光物质并不能发射荧光，这是因为激发态分子的去激发过程中，除发射荧光(磷光)外，还有无辐射跃迁过程与之竞争。所以，荧光量子产率与各种去激发过程的速率常数有关。表14.4列出分子吸光及去激发的过程及速率常数。过程表示式一级反应速率常数吸收（激发）

振动弛豫/内部转移

荧光发射

系间跨越

磷光发射

S1的碰撞猝灭（外转移）

S0＋hva→S1（或S2）

S2

～～→S1，0

S1，0→S0＋hvf

S1‘～～→T1

T1，0→S0＋hvp

S1‘＋Q～～→S0＋Q＋热量Ka

KIC

Kf

KISC

Kp

Ka[Q](准一级)

表14.4激发及去激过程与速率常数因此，ΦF可以表示为:式中，ΣKi为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和，即ΣKi

＝KIC＋KISC＋KQ[Q]。从上式可以看出，凡是能使Kf值升高而使其它Ki值它降低的因素，都可以提高量子产量，增强荧光。对于高荧光分子(如荧光素)来说，Φf接近于1，说明该分子的Kf较大，ΣKi相对于Kf不可忽略不计。一般荧光物质Φf小于1，不发荧光的物质Kf为0，Φf＝0。一般说来，Kf主要取决于化学结构，Ki则主要取决于化学环境的因素，同时也与化学结构有关。2.荧光与分子结构的关系(1)具有电子跃迁类型的结构：

实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由或跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生或跃迁而产生荧光。而其中光吸收时跃迁的摩尔吸光系数比跃迁的大102～103倍，跃迁的寿命(10－7～10－9)比跃迁的寿命(10－5～10－7)短，因此荧光发射的速常数Kf值较大，荧光发射的效率高。因此，跃迁发射荧光的强度大。此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态跃迁至三重态的速率常数KISC小也有到于荧光的发射。总之，跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。

发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有双键(π键)的结构体系。共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。

(2)具有刚性平面结构：实验发现，多数具有性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量处部转移的损失，有利于荧光的发射。而且平面结构可以增大分子的吸光截面，增五大摩尔吸光系数，增强荧光强度。金属螯合物荧光。这一类螯合物中金属离子的外电子层具有与惰性气体相同的结构，为抗磁性的离子，它与含有芳基的有机配位体形成螯合物时多数会发射较强的荧光。这是因为原来的配位体虽有吸收光构型，但其最低激发单重态的S1是n，型，及缺乏刚性平面结构，所以并不发荧光，而与金属离子配合后，配位体变为最低激发单重态的，型，且由于螯合物的形成，而具有则性平面结构，因此能发射荧光。(3)取代基的影响★给电子取代基使荧光加强。属于这类基团的有－NH2，－NHR，－NR2，－OH，－OR，－CN等。由于这些基团上的n电子云几乎与芳环上的π电子轨道平行，因而实际上它们共享了共轭π电子，形成了p～π共轭，扩大共轭体系。因此，这类化合物的荧光强度增大(比较表14.2中的苯、苯胺、苯酚、苯基氰)，考察这类取代基对荧光特性的影响时必需注意，这类基团中的n电子容易与极性溶剂作用转化为共盐(共轭碱或共轭酸)，如酚在NaOH中，－OH转化为－O－，苯胺在酸中，－NH2转化为－NH3＋，它们的荧光均大为减弱。表14.2部分取代基对苯的荧光特性的影响情况表化合物分子式荧光波长荧光的相对强度苯C6H6270－31010甲苯C6H5CH3270－32017丙基苯C6H5C3H7270－32017氟代苯C6H5F270－32010氯代苯C6H5Cl275－3457溴代苯C6H5Br290－3805碘代苯C6H5I－0苯酚C6H5OH285－36518酚离子C6H5O－310－40010甲苯醚C6H5OCH3285－34520苯胺C6H5NH2310－40520苯胺离子C6H5NH3＋－0苯甲酸C6H5COOH310－3903苯基氟C6H5CN230－36020硝基苯C6H5NO2－0★吸电子基团使荧光减弱而磷光增强。属于这类基团的有如羰基(－COOH，－CHO，)，硝基(－NO2)及重氮基等。这类基团都会发生跃迁，属于禁阻跃迁，所以摩尔吸光系数小，荧光发射也弱，而的系间跨跃较为强烈，同样使荧光减弱，相应磷光增强。例如二苯甲酮其的系间跨跃产率接近1，它在非酸性介质中的磷光很强。和给电子基团一样，吸电子基团也都存在n电子，所以对极性溶剂及酸，碱介质都较为敏感。★重原子效应使荧光减弱而磷光增强。荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。所谓重原子取代，一般指的是卤素(Cl、Br和I)原子取代，芳烃取代，芳烃取代上卤素原子这后，其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，而磷光通常相应地增强，这种效应称为“重原子效应”。这种效应被解释为，由于重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，使得荧光体中的电子自旋一轨道偶合作用加强，系间跨跃显著增加，结果导致荧强度减弱，磷光强度增强。表14.3卤代萘的荧光及磷光光谱的情况化合物*φp

/φF荧光波长磷光波长（nm）萘0.0933154701－甲基萘0.0533184761－氟萘0.0683164731－氯萘5.23194831－溴萘6.43204841－碘萘>1000没观察到4883.环境因素对荧光的影响影响荧光强度的因素除了荧光物质的本身结构及其浓度以外，环境也是一个很重要的因素，主要的溶剂、温度、介质酸度、氢键的形成及其它的因素。(1)溶剂的影响。同一种荧光体系在不同的溶液中，其荧光光谱和荧光强度都可能会有显著的差别。对于荧光发射的主要电子跃迁类型跃迁来说，电子激发态比基态具有更大的极性，所以随着溶剂极性的增大，对激发态比对基态产生更大的稳定作用，因此降低了跃迁的能量，荧光光谱发生红移，而且荧光增强。

表14.58-巯基喹啉在不同溶剂中荧光特性溶剂介电常数荧光发射峰λ/nm荧光量子产率ΦF四氯化碳

氯仿

丙酮

乙氰2.24

5.2

21.5

38.8390

398

405

4100.002

0.041

0.055

0.064温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低，图14.7为不同温度下邻菲罗啉的荧光光谱。一般认为辐射过程速度不随温度变化，因此，荧光量产率的变化反映了非辐射跃迁过程速率的变化。随着溶液温度的升高，介质粘度减小，分子运动速度变大，从而使荧光分子与溶剂分子或其它分了的碰撞机率增加，使内、外能量转换速率加快，荧光效率降低。(2)温度的影响。带有酸性基团或碱性基团的大多数芳香族化合物，其荧光特性都与溶液的酸度(pH)有关。这是因为在不同酸度介质条件下，荧光体的存在型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸，碱性也有所差别。因此不同酸度下，荧光光谱和荧光强度都可能发生变化。所以在荧光分析中一般都要较严格地控制溶液的pH值。下列为两个实例:(3)介质酸度的影响(4)表面活性剂的影响表面活性剂的存在对荧光光谱及强度都有会产生影响。荧光体在由表面活性剂形成胶束的微环境中，不仅可以减少非辐射去激化过程和猝灭过程的速度，提高荧光量子产率，而且由于表面活性剂参与组成更高次和配合物而增大配合物分子的有效吸光截面积，导致摩尔吸光系数的增大因此，在胶束溶液中，荧光强度增强，测定的灵敏度提高。多元配合物的形成通常也可以增强荧光强度，提高荧光测定的灵敏度。(5)溶解氧的影响溶解氧的存在会使荧光效率降低。为何？原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。有的认为氧和其它须磁性的物质一样，它们之所以会使荧光猝灭，是由于它们能够促进激发单重态的荧光分子的系间跨跃()。（三）荧光效率与荧光物质浓度的关系荧光强度If正比于吸收的光量(光强)Ia及荧光量子产率Φf：If=IaΦf

吸收的光量(光强)Ia应为入射光的光强的光强I0与透射光的光强It

之差，即：Ia＝I0－It

根据吸收定律(朗伯-比耳定律)：所以:式中，ε为摩尔吸光系数，b为样品溶液的光程(即液池的厚度)，c为样品的摩尔浓度。

而的展开式为:当浓度C很稀，吸光度A＜0.05时，则展开式的高次项可忽略，即:所以：当I0及b一定时:If＝Kc荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法定量分析的依据。但是，应该注意的是，此式只适合于荧光物质的稀溶液。当c较大，吸光度A＜0.05时，线性关系将受到破坏。当c较大，吸光度A＞0.05时，线性关系将受到破坏。原因：(1)由省略高次项引起；(2)由荧光猝灭效应引起。荧光的猝灭：指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有为下几种类型:何为荧光猝灭效应？碰撞猝灭：

碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。它指的是处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，释放热量给环境以无辐射的形式跃迁回基态，产生猝灭作用(这种猝灭也称动态猝灭)。碰撞猝灭效应随温度的升高而增强，而随粘度的增大而降低。2.生成化合物的猝灭

生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，它指的是基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭，可用下式表示:

从上式也容易推导出荧光强度与猝灭剂平衡浓度之间的关系

式中(If)0及(If)q分别为加入猝灭剂Q之前及之后的荧光强度，CM为荧光物质的总浓度。利用上面的关系式可以用于荧光猝灭法的定量分析。3.能量转移猝灭

当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光，使荧光猝灭，而猝灭剂被激发，这是俗称“内滤作用”。4.氧的猝灭

氧的存在会使荧光效率降低5.转入三重态的猝灭

在“重原子效应”段落已经叙述，溴化物和碘化物都能产生“重原子效应”，促使荧光分子的激发单重态转入激发三重态，导致荧光的猝灭。上面也已提及，氧的猝灭作用也可能是O2促使荧光体分子转入激发三重态所致。6.荧光物质的自猝灭

当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。自猝灭可能有如下几个原因：★荧光物质分子之间的碰撞能量损失，这实际上是能量的外部转移形式；★荧光物质的自吸收，当荧光物质的吸收光谱与荧光发射光谱重叠时，会发生自吸收现象，处于S1激发态的分子发射的荧光被处于基态的分子所吸收，使荧光强度降低；★荧光物质分子的缔合。某些荧光体分子处于基态时会形成二聚体或多聚体，或者激发态分子

与基态分子M形成激发态二聚体(M*M)。这些聚合物与荧光单体一般都会具有不同的荧光特性，有的使荧光强度降低甚至不发射荧光，有的使光谱发生变化。（四）荧光激发光谱和发射光谱荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉用到两种辐射，即激发光(吸收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。1.激发光谱

通过测量荧光(或磷光)体的发光强度)随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法是，通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体，发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光(磷光)强度，最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用λex表示。萘的激发光谱、荧光和磷光光谱2.发射光谱通过测量荧光(或磷光)体的发光强度随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。其测绘方法，是固定激光发光的波长，扫描发射的光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用λem表示，磷光发射波长比荧光来得长，萘的激发光谱、荧光和磷光光谱（一）荧光仪器的基本构成：

测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器和信号显示记录器。★特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。三、荧光分析仪器1.激发光源●高压汞灯：高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源，主要有365、405、436nm的三条谱线，尤以365nm谱线最强，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。激发光源应具有足够的发光强度、适用波长范围宽，稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧灯。●

氙弧灯：氙弧灯通常就叫氙灯，是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，常温时其压力为5atm，工作时压力为20atm，具有光强度大，在200～800nm范围内是连续光源的特点。氙灯的灯内气压高，启动时的电压高（20～40KV），因此使用时一定要注意安全。●可调谐染料激光器：是一种新型的荧光激发光源。这种光源不需单色器和滤光片，具有单色性特，强度大，等优点。但是仪器设复杂，所以应用还不广泛。2.单色器

荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，称为荧光分光光度计。光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器3.样品池

荧光分析的样品池通常用石英材料做成，它与吸光分析法的液池不同在于，荧光样品池的四面均为磨光透明面，同时一般仅有厚度为1cm的池。4.检测器

简易型的荧光计可用目视检测，或用硒光电池，光电管检测。现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的于扰。（二）荧光分析法的灵敏度与紫外可见分光光度法比较，荧光分析法的灵敏度要高出2～4个数量级。为何？1.从方法原理上看根据，荧光物质的浓度与荧光强度成正比，荧光强度正比于入射光的强度。所以增大光源的强度可以提高灵敏度，降低检测限；而在紫外—可见光光度法中，

，吸光物质浓度与入射光和透射光比的对数值成正比，即吸光度。不论是增加入射光强度，还是提高检测器灵敏度，都不会引起吸光度的变化。

A=Kbc=lgI0It2.从仪器装置上看

（1）根据，荧光法可采用强光源和高灵敏度检测器提高方法的灵敏度。（2）荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测器，很微弱的荧光都可以检测，所以检测限较低；而吸光分析法是在亮背景下检测透射光与入射光强度的比值，所以当强度较小时，透射光与入射光强度相差很小，因此不能准确的检测，所以检测限较高。

与紫外可见分光光度法比较，荧光分析法的灵敏度要高出2～4个数量级。为何？四、荧光分析法的应用荧光分析法目前还主要用于无机物和有机物的定量分析，但随着其研究的深入，在定性分析、结构分析及作为某些研究领域的手段也日渐增多，具有较为广阔的应用前景。

荧光定量分析的方法主要有校正曲线法，依据荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系，首先绘制校正曲线，再进行未知的分析；其次还有比较法，在同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液的荧光强度，直接通过比例计算求得试样中荧光物质的含量。（一）无机化合物的分析1.直接荧光法

直接能应用无机化合物自身的荧光进行测定的为数不多，无机化合物的荧光测定主要依赖于待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。这种方法称为直接荧光法。某些元素虽不与有机试剂组成会发光的配合物，但它们可以从其他会会发荧光的金属离子--有机试剂配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，由荧光强度降低的强度来测定该元素的含量，这种方法称为荧光猝灭法。有些情况下，金属离子与能发荧光配位体反应，生成不发荧光的配位体，导致荧光配位体的荧光猝灭，同样可以测定金属离子的含量，这也属于荧光猝灭法。

2.荧光猝灭法（一）有机化合物的分析脂肪族化合物的分子结构较为简单，会发荧光的为数不多。但也有许多脂肪族化合物与某些有机试剂反应后的产物具有荧光性质，可用于它们的测定。芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射荧光，可以直接进行荧光测定。有时为了提高测定方法的灵敏度和选择性，常使某些弱荧光的芳香族化合物与某些有机试剂反应生成强荧光的产物进行测定。例如降肾上腺素经与甲醛缩合而得到强荧光产物，然后采用荧光显微法可以检测组织切片中含量低至10－17g的降肾上腺素。

在生理科学研究工作及医疗工作中，所遇到的分析对象常常是分子庞大而结构复杂的有机化合物，如维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化合物、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等，这些复杂化合物许多均能发射荧光，可以用荧光分析法进行测定或研究其结构或生理作用机理。在现代的分离技术中，以荧光法作为检测手段，常可以测定这些物质的低微含量，荧光免疫分析法也是医学研究的一种重要手段。第二节磷光分析法（一）提高磷光分析灵敏度的途径磷光的发射过程必须先由激发单重态经系间跨越至激发三重态（）的无辐射过程，然后再从激发三重态的最低振动能级经过禁阻跃迁至基态的辐射跃迁过程，这在动力学上是处于不利的情况。经历的时间较长，容易受到外部转移的干扰而使磷光强度减弱，甚至完全消失。因此，为了获得较强的磷光，提高磷光测定的灵敏度，扩大磷光分析的测定范围，宜采用下列一些措施。1.增加试样的刚性增加试样的刚性可以减少质点间的碰撞几率，从而减少无辐射跃迁的光活化过程，从而提高磷光发射的几率，提高磷光强度。低温磷光就是基于这一原理而建立起来的。在低温磷光分析中，液氮是最常用的合适的冷却剂。在液氮温度（77℃）下，所使用的溶剂具有足够的粘度并能形成透明的刚性玻璃体，从而有效地降低质点碰撞的能量外部转移，提高磷光强度。2.固体基质磷光法这种方法是基于测量吸附于固体基质（载体）上的有机物质所发射的磷光而进行分析的。由于它有效地阻止了质点的碰撞，它们可以进行室温磷光测定。理想的载体应是既能将分析物质牢固地吸附在表面或基体中，减少三重态碰撞猝灭等非辐射光活化过程，增强磷光强度，本身又不产生荧光背景。较常用的载体是滤纸和纤维素色层纸。3.胶束增稳磷光法当溶液中的表面活性剂浓度到达临界胶束浓度后，便聚集成胶束。磷光体进入胶束时，改变了磷光体的微环境及定向的约束力，从而强烈地影响磷光体的物理性质，增强了其刚性，减少碰撞的能量损失，增强了激发三重态的稳定性，增强了磷光强度，从而也可以实现室温磷光测定。例如，在含有表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）的溶液中，掺入重原子离子Tl（Ⅰ）或Pb（Ⅱ），可观察到萘、芘和联苯的强烈室温磷光。4.重原子效应在含有重原子的溶剂如碘乙烷或溴乙烷中，有利于系间跨越，使磷光增强。除了使用含有重原子的溶剂外，还可以采用Ag盐Pb盐或Tl盐等重金属原子盐类。（二）磷光分析仪器

磷光分析仪器与磷光分析仪器同样由五个基本部件组成，但需要有一些特殊的配件，在比较好的荧光分析仪器上都配有磷光分析的配件，因此两种方法可以用同一仪器。1.样品池需配有冷却装置

对于溶液磷光的测定，常采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻。通常把试液装入内径约1-3mm的石英细管（液池）中，然后将液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶内，激发光通过杜瓦瓶的没有镀银的部位照射到试样上，所产生的磷光经由直角方向上的类似部位投射到发射单色器后加以检测。2.磷光镜有些物质会同时发射荧光和磷光，因此在测定磷光时，必须把荧光分离去。为此目的，可利用磷光寿命比荧光长的特点，在激发单色器和液池之间及在发射单色器和液池之间各装上一个斩波片，并且由一个同步马达带动。这种装置称为磷光镜，它有转角式（以图14.12a）和转盘式（如图14.12b）两种类型，尤以后者更为通用。（三）磷光分析法的应用磷光分析法主要用于有机化合物的测定，如稠环芳烃和石油产品的分析，农药、生物碱和植物生长激素的分析，药物和临床分析等。此外磷光分析技术也已应用于生物活性物质的化验及细胞生物学