免疫细胞分离技术(终)

免疫细胞分离技术

（针对淋巴细胞）41110111向珍娟41110124龚琦青41110131周武免疫细胞分离技术的意义我们知道进行有关细胞免疫方面的检测，特别是有关免疫细胞功能的体外实验，往往须将待检淋巴细胞从血液或组织中分离出来，而外周血会有多种细胞成分，包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和血咆群体。但有些细胞如淋巴细胞的物理特性及生化特性与其他细胞差异甚微，用简单的方法不容易分纯，因此产生了专门的细胞分离纯化技术。白细胞分离吞噬细胞的分离和收集淋巴细胞分离

白细胞的分离自然沉降法聚合物加速沉降法自然沉降法采集血液试管直立静置室温（30~60min）抗凝（如加肝素）血浆层白细胞层红细胞层吸管吸取白细胞层置新试管中离心弃上清并洗涤加蒸馏水低渗处理（裂解红细胞）反复洗涤得纯度较高的白细胞悬液聚合物加速沉降法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。优点：本法的细胞获得率比自然沉降法高。吞噬细胞的分离和收集

方法：斑蝥敷贴法操作：用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞；优点：可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作进一步体外分离，细胞量损失较少；缺点：此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。2023/2/3淋巴细胞分离三步走（一）外周血单个核细胞的分离（二）纯淋巴细胞群的采集（三）淋巴细胞亚群的分离（一）外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。Ficoll分层液法

外周血单个核细胞的分离Ficoll分层液法

Percoll分层液法分层液基本要求

①对细胞无毒

②基本等渗

③不同于血浆等分离物质

④有一定的比重最佳选择（目前）

Ficoll（聚蔗糖-泛影葡胺溶液）：2份6％聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%泛影葡胺生理盐水溶液组成，其比重为1.077±0.002.

分离过程（1）分层液置试管底层（2）肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面（3）水平式离心（4）不同层次的液体和细胞带（5）吸取单个核细胞层Ficoll分层液法

分离成品：淋巴细胞

单核细胞分离纯度：95%左右，其中淋巴细胞约占90%~95%

Percoll分层液法Percoll分离液法是一种连续密度梯度离心分离法。Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。Percoll液经高速离心后可形成一个连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。分离过程（1）用Percoll原液(密度1．135)与约等量的磷酸缓冲液均匀混合（2）高速离心后，形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度（3）将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上（4）低速离心后，得四个细胞层。表层为死细胞残片和

血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单核细胞(78％)，下层富含淋巴细胞(98％）。Percoll分层液法优点：纯化单核细胞和淋巴细胞；缺点：操作流程较长，手续较多。连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图（二）纯淋巴细胞的分离

根据密度离心分离法获得的淋巴细胞主要混合在单个核细胞悬液中，由于淋巴细胞在数量上占单个核细胞的大多数，因此，单个核细胞有时也可以大致地代表淋巴细胞直接用于某些实验，但严格地讲，采用上述方法获得的单个核细胞需去除单核细胞才能较为准确地代表淋巴细胞用于实验。纯淋巴细胞群的采集

实验原理：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性；实验方法：粘附贴壁法吸附柱过滤法磁铁吸引法2023/2/3粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。缺点：因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。2023/2/3吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞；优点：此法简单易行，对细胞极少损害。2023/2/3磁铁吸引发法原理：利用单核细胞具有吞噬的特性；操作：在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。2023/2/3（三）淋巴细胞亚群的分离

原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化；阳性选择法：凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法；阴性选择法：选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞的方法；2023/2/3淋巴细胞亚群的分离通过以上两步的实验分离操作，我们得到纯度比较高的淋巴细胞混合液。然而在具体的实验操作中，我们还需要将淋巴细胞进一步的进行分离。原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化；阳性选择法：凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法；阴性选择法：选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞的方法；分离方法1.E花环沉降法2.尼龙毛分离法3.免疫吸附分离法4.免疫磁性微珠分离法5.流式细胞仪分离法E花环沉降法基本原理：T细胞有羊红细胞受体(E受体)，可以与羊红细胞结合形成较大的E花环的特性，可将T细胞和B细胞分离。分离过程（1）将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合（2）淋巴细胞形成E花环（3）用淋巴细胞分层液分离（4）浮悬在分层界面的细胞群则富含B细胞，而T细胞由于与羊红细胞结合形成E花环后比重较大，则沉降在管底相关拓展：用神经氨酸酶预处理羊红细胞将有利于花环的形成和增加稳定性。另外将沉降在管底与羊红细胞结合的T细胞经低渗法处理可使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，又可得到E受体阳性的T细胞群。尼龙毛分离法

原理：本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。操作方法：取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37℃温箱静置1～2h。用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。优点：如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。2023/2/3免疫吸附分离法----

亲和板结合分离法原理：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取；2023/2/3亲和板结合分离法同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。2023/2/3亲和板结合分离法（阳性选择法）（1）将相应抗体结合于塑料平板上（2）加细胞悬液（3）各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志，抗原阳性的细胞与相应的固相抗体结合，吸附在平板上（3）多次细胞洗涤后我们将得到吸附在平板上的抗原阳性细胞（4）同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，即将其用于阴性选择，本法更合适。2023/2/3免疫磁珠法分离细胞原理：

免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：

阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞

阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞。荧光激活细胞分离仪(FACS)分离法

主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞