杨璐-化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体(西北大学硕士学位毕业PPT)2011.6

化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体答辩人：杨璐导师：崔亚丽教授李如琳副教授

西北大学Contents1.背景介绍3.全文总结2.实验部分梅毒

●

梅毒螺旋体

●严重性传播疾病

●发病率不断上升

2010年4月国家卫生部全国法定传染病疫情报告：全国乙类法定传染病发病第３位梅毒检测：●孕前检查

●供血者血液常规筛选检查西北大学医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法快速血浆反应素环状卡片实验试验（RPR）和甲苯胺红试验(TRUST)初筛假阳性高判断主观梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）

确认

判断主观操作繁琐要求严格梅毒ELISA实验灵敏度有待进一步提高

西北大学化学发光免疫分析技术免疫分析系统化学发光分析系统（抗原、抗体，免疫反应）★免疫分析高特异性及化学发光高灵敏度于一体（酶的化学发光底物或氧化剂）西北大学梅毒螺旋体抗体化学发光法检测灵敏度极高自动化化学发光技术

●灵敏度极高

●较宽线性范围

●精密度高

●容易实现自动化★广泛应用于医学、食品、分析化学等领域西北大学化学发光法检测梅毒的商品化试剂盒国外：

Abbott：ARCHITECTSyphilisTP磁粒

国内：北京科美东雅生物技术有限公司：梅毒螺旋体抗体化学发光试剂盒酶标板

西北大学聚乙烯酶标板●板表面包被面积有限●反应空间有限●灵敏度受限化学发光固相载体的选择磁性微粒●比表面积大●分散性好●易分离●灵敏度更高西北大学金磁微粒化学发光检测方法GoldMag-AS微米金磁微粒1.生物分子固定化容量大

2.超顺磁性，易分离

西北大学包被反应检测实验原理西北大学第一部分方法的优化1HRP标记抗原稀释液的确定2包被抗原最佳用量及酶标抗原最佳工作浓度的确定3样本稀释液的确定4保护剂的选择西北大学HRP标记抗原稀释液的确定aPBST+20%小牛血清bPBST+0.1%BSAcPBST+0.5%BSAdPBST+1%BSAePBST+1.5%BSA降低非特异性吸附：

加入非特异性蛋白与表面活性剂阴性样本的发光值西北大学包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定

抗原包

被量(ng/孔)酶标抗原稀释度

701402102803501:2000PN660271652562954603945677336671:3000PN21742744571735502494644947601:4000PN13746543501538501816563171541:5000PN1404247850118142554342943341:6000PN12142319386574249434201927最佳抗原包被量：210ng/孔；最佳酶标抗原工作浓度：1：3000西北大学样本稀释液的确定阳性血清稀释倍数检测结果1×PBS生理盐水PBS+0.1%BSA

正常人血清1:25++++1:50++++1:100++++1:200++++1:400++++1:800++++1:1600++++1:3200++++1:6400+-+-++1:12800--++1:25600--+-+-1:51200----最佳样本稀释液：PBS+0.1%BSA检测灵敏度与正常人血清相当西北大学保护剂的选择保护剂X对HRP标记抗原的保护作用良好HRP标记抗原置于37℃、放置6天西北大学保护剂X对包被抗原金磁微粒的保护作用包被抗原金磁微粒置于37℃、放置6天稳定性很好西北大学保护剂Proclin300与保护剂X的对比实验选定浓度为0.05%的Proclin300作为保护剂西北大学保护剂Proclin300对HRP标记抗原的保护作用含0.05%Proclin300的HRP标记抗原置于37℃、放置6天西北大学第一部分实验小结

在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳工作条件如下：1.HRP标记抗原稀释液：PBST+1%BSA作为HRP标记抗原稀释液；2.抗原包被量：210ng/孔(7µg/mg)；3.酶标抗原稀释浓度：1:3000时，发光强度达到最佳；4.血清样本稀释液：PBS+0.1%BSA；5.保护剂：浓度为0.05%Proclin300的PBS缓冲液。西北大学4参考值6对比实验1稳定性3标准曲线25精密度特异性第二部分实验方法的评价西北大学稳定性化学发光试剂分别置于4℃冰箱和37℃生化培养箱中放置6天将阳性血清分别稀释50倍、100倍、200倍、400倍后进行检测西北大学精密度国家标准（≤15%）批内差：

2.86%～5%次数检测结果阳性检测平均值RSD（%）1PN542315573523624915605715574715594923586052PN59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大学批间差：

5.1%～9.7%西北大学次数

检测结果

批次1批次2批次3阳性检测平均值RSD（%）1PN389515391884829154822154487846921544419.72PN432915405284723154810154541154752845346.53PN3987841891544288478384431154246843446.24PN3995840968462415474284267843681543496.75PN401615397984572154226841461541441541815.1质控标准品10次重复测定结果质控品：抗-TP标准物质（2NCU/mL）相对标准偏差：5.42%西北大学标准曲线将梅毒螺旋体抗体质控标准品（4NCU/mL）梯度稀释，在0.25～4NCU/mL范围内线性良好Y=599.1X-165.9R2=0.9980西北大学参考值（临界值确定）检测100例临床阴性血清样本临界值：⑴P/N≥2.8，计算得出该方法的临界值为：COV=72.8⑵P≥X+3SD，计算可得临界值为：COV=47.6⑶P/N≥2.1，计算可得临界值为：COV=54.6发光值=54.6西北大学特异性阴性符合率均为100%·80例临床血清样本·20例乙肝阳性血清样本（TP阴性）·20例丙肝阳性血清样本（TP阴性）本次实验：COV=N×2.1=54.6发光值西北大学乙肝阳性样本检测结果丙肝阳性样本检测结果COV=54.6COV=54.6发光值发光值乙肝血清样本丙肝血清样本阴性符合率均为100%西北大学化学发光磁酶免疫分析法与商品化化学发光试剂盒对比灵敏度比商品化化学发光试剂盒提高4倍阳性血清稀释倍数检测结果商品化试剂盒化学发光磁酶免法(MECLIA)1:100++1:200++1:400++1:800++1:1600++1:3200++1:6400-+1:12800-+1:25600-+-1:51200--西北大学

化学发光磁酶免法（COV=N×2.1=53.2）商品化化学发光试剂盒COV=N×2.1=26151）特异性对比实验：二者相当，阴性符合率均100%发光值发光值20例阴性血清样本20阴性血清样本COV=53.2COV=26151西北大学西北大学第二部分实验小结国家法规：《体外诊断试剂注册管理办法》·分析性能评估资料：分析灵敏度、分析特异性、检测范围批内不精密度、批间不精密度等项目·参考值（参考范围）确定·稳定性研究资料《发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则》根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行检验，检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。稳定性：4℃，及37℃加速破坏性实验，均显示保存稳定性良好；精密度：批内差在2.86～5%，批间差在5.1～9.7%，对质控品重复10次检测，变异系数为5.42%，均达到国家标准（≤15%）方法评价结果西北大学标准曲线：在0.25～4NCU/mL范围内线性范围良好临界值：临界值为阴性对照血清均值的2.1倍特异性：检测临床TP抗体阴性血清，阴性符合率为100%，特异性良好对比实验：灵敏度较商品化化学发光试剂盒提高4倍，特异性二者相当西北大学●稳定性●精密度●线性范围●参考值●特异性●对比实验●HRP标记抗原稀释液●抗原包被量●酶标抗原稀释浓度●血清样本稀释液●保护剂对方法进行比较全面的评价方法的进一步优化初步建立的化学发光磁酶免疫分析法全文总结：西北大学试剂盒研制成功中试放大梅毒抗体临床科研血清盘梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品临床试验西北大学主要生产工艺及反应体系研究资料

半成品试剂盒的检定成品试剂盒的检定

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