液相色谱常见故障

液相色谱常见故障诊状

可能的原因

解决方法

(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温

2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够用>25mmol/L的缓冲液

4.柱污染每天冲洗柱

5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相

6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速

2.样品超载降低样品量

3.键合相流失流动相PH值保持在3~7.5

检查柱的方向

4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀

5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长

1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,

排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱

3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5(四)

出现肩峰或分叉1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂

(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)

基线噪声1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品泵的操作与维护正如人的心脏一样,高效液相色谱仪中的高压恒流泵必须能可靠的运转.但是要做到长时间低维护的可靠运转,就需要对泵有足够的了解,并注意与之有关的事项.

1.通常的设计

目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复式柱塞泵,结构原理如图1所示.凸轮与连杆将电机的圆周运动转变为柱塞杆的线性运动,在有单向阀的结构中,柱塞杆将常压下储液瓶中的流动相吸至泵腔后再送出,其耐压可达41MPa.通过改变凸轮的形状和电机的转速及柱塞杆的尺寸可以将流动相的脉动降至最小.如果对泵的各个部分都有清楚的认识,将来排出操作过程中出现的故障就很简单了.单向阀:泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆.

是单向阀的示意图.该单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成.在压力的作用下宝石球离开阀座流动相流过单向阀;反之,在反向力的作用下,宝石球回到阀座上此时流动相不再流过单向阀.显然宝石球与阀座之间的配合必须非常适合才能防止流动相的泄漏.为了保证单向阀不发生泄漏,一些单向阀中安装了两套宝石球和阀座,也有一些单向阀是将宝石球用一个合适的弹簧压在阀座上.在不同的应用领域,单向阀阀体的材料有所不同,例如考虑生物兼容性的系统,单向阀的阀体往往采用金属钛,而不用不锈钢.为了降低成本和减少维护费用,一些生产厂商还采用了可置换式的卡套式塑料单元件,当然其功能仍保持不变柱塞杆与密封圈:柱塞杆在泵头内做前后的往复运动,完成将流动相吸入泵头然后再输出的过程.柱塞杆的典型材料蓝宝石,不锈钢或其他材质的柱塞杆往往用于一些特殊的领域.泵头内的密封圈是防止流动相从柱塞杆的周围流走而设计的.

是柱塞杆的运动过程示意图.

在吸液过程中由于柱塞杆的运动而在泵腔内形成负压.此时因色谱柱的,泵头外的压力显然高于泵头内,在这两种压差下出口单向阀的宝石球落回到阀座上;而对于入口单向阀,因为外界大气压大于泵腔内的压力,宝石球离开阀座,流动相顺利的进入泵腔.与此相反的输液过程见图3-b.由于柱塞杆的运动使压力增加,入口单向阀的宝石球落回到阀座,入口单向阀处于关闭状态;当泵头内的压力继续增加,并且超过了泵头外的色谱柱的反压时,出口单向阀开启,流动相输出.进样阀在进样过程中，必须是非常清洁的，否则得不到较好的结果。进样阀切换到进样位置（Inject）后，要在此位置保持一段时间，使流动相充分冲洗样品定量管，这样可以保证有较高的精确度，而且不用另外再冲洗样品定量管。这种由色谱仪器控制的冲洗显然要比手动冲洗更好些。注意：冲洗需要的流动相体积至少为所进样品体积的10倍。例如，如果取20μL样品至100μL样品定量管中，而流动相此时的流速为1mL/min，则需要在进样位置至少保持12s，即：20μL×10/1000μL·min-1=0.2min=12s。

当样品定量管经过充分的冲洗后，可以将旋柄转回取样位置（Load），也可以继续保持在进样位置，到下次取样前才切换回取样位置。在切换回取样位置时，将样品进样针或微量样品进样针从进样阀中拔出。

为防止交叉污染，正常情况下不必每次进样后都冲洗进样阀注射针导入口。进样阀内根据专利设计的直接连接进样孔，可以使注射针头的前端直接连接到样品定量管的末端，没有其他空间供样品残留。这样在下一次进样时，就不会有上一次残留的样品进入样品定量管。但是在进样针头插入或拔出过程中，会有痕量的样品沉积在针头密封区域。精密的测定显示这种残留有1nL~10nL。这表明进20μL样品，会残留0.005%~0.05%。每次进样后冲洗注射针导入口可以将此残留冲洗干净。冲洗注射针导入口的过程为：设定流动相的流速为0.1mL/min~1mL/min，将注射针导入口冲洗头（Rheodyne部件号7125-054）连接到一只体积相对较大的注射器上，用大量的流动相只在进样位置清洗注射针导入口。这样进入进样阀中的液体绕过样品定量管由样品溢出管5#口排出。这一过程可以将注射针导入口、引导管、注射针导入管和注射针密封圈彻底清洗。而采用注射器完全插入式的冲洗方式，则不能全部清洗上述部分的表面。在取样位置将注射针插入注射针导入口时，针头推动注射针密封圈内少量样品液体（上一次冲洗注射针导入管留下的）进入样品定量管。当该样品液体与所用的流动相组成不同，且同时采用部分充满定量管进样方式时，在高灵敏度的检测器上可能出现怪峰。所以冲洗注射针时最好用流动相冲洗。如果已发现有严重的交叉污染现象，请检查是否有下列原因造成：

ⅰ.使用的注射针头长度不够（针头的长度至少要5cm），注射针末端不能到达定子表面。

ⅱ.注射针没有充分插入注射针导入口。

ⅲ.注射针导入口内的污染物或针头密封磨损下来的削片，使注射针头末端不能接触定子表面。

如果不考虑交叉污染，每进样10次或20次最好冲洗一下注射针导入口，这样可以保证注射针导入管内充满流体。在注射针插入或拔出的过程中，清洗注射针头或稀释污染这一区域的样品的同时也使注射针导入口和样品