分子生物学第8章

第八章印迹杂交技术分子生物学常用的分析技术之一DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法（免疫印迹法）

第一节核酸分子杂交

核酸杂交技术是在DNA变性和复性原理的基础上建立起来的一种分子生物学技术

一、变性（denaturation）在某些理化因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程称为核酸的变性核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，但并不涉及共价键的断裂DNA解链曲线DNA变性的本质是氢键的断裂核酸的变性因素变性方法热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、尿素和甲酰胺）增色效应（hyperchromiceffect）由于DNA变性而引起的光吸收增加的现象使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度(Tm)、变性温度、熔点

DNA的解链温度一般在82-95℃

，与DNA的分子大小和碱基组成、溶液的pH值和离子强度（+）等有关

二、复性DNA复性：缓慢降温可以使热变性DNA重新形成互补双链结构DNA的最适复性温度通常比解链温度低20-25℃复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应检测DNA紫外吸收的变化可以分析其变性和复性

不是简单的逆变性过程，受多种因素影响:①DNA浓度越高，两股互补链相遇的可能性就越大，因而复性越快②序列简单的DNA(例如重复序列)复性快，序列复杂的DNA(例如单一序列)复性慢，因而可以通过测定复性速度分析DNA序列的复杂性③DNA片段越大，寻找完全互补序列的难度就越大，因而复性越慢④DNA溶液的离子强度越高，两股互补链重新结合的速度就越快，因而复性越快变性复性

DNA-DNA杂交双链分子三、杂交与核酸分子杂交技术

杂交定义不同来源的、序列互补的单链RNA、DNA，或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连接为双链分子的过程。核酸杂交类型单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA）单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）核酸分子杂交技术定义：将已知序列的单链核酸片段进行标记后，再与另一种未知序列的待测核酸样品进行杂交，从中鉴定互补序列，以分析该样品中是否存在特定基因序列、基因序列是否存在变异，或研究目的基因的表达情况探针(Probe)：是带有标记物且序列已知、用于鉴定互补序列的单链核酸片段根据杂交体系的不同，核酸分子杂交可以分为：1、液相杂交：待测核酸和标记的探针都游离于溶液中，在一定条件下进行杂交优点：速度快、效率高，操作简便缺点：难以有效避免待测核酸的复性杂交之后也不易将未杂交的多余探针完全除去，误差较大2、固相杂交：将待测核酸先固定在固相支持物上，然后与溶液中的游离探针进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上优点：既可以避免待测核酸的复性，又可以通过漂洗除去末杂交的多余探针，而且结合在固相支持物上的杂交体的检测也很方便印迹杂交技术中的核酸分子杂交就是以固相杂交为基础的第二节探针与标记

合适的探针具备以下条件:①具有高度特异性，只与待测核酸杂交。因此，通常首选编码序列制备探针②为单链核酸，用双链核酸制备的探针使用前要先变性解链③带有标记物，标记物灵敏度高而稳定，检测方便

一、探针种类

1·基因组DNA探针（最常用的DNA探针）多为某一基因的全部序列或部分序列2·RNA探针杂交效率高、稳定性高、敏感性和均一性强非特异性杂交较少、低本底3·cDNA探针

不含内含子等非编码序列，特异性高，研究基因表达不易制备4·寡核苷酸探针

根据已知核酸序列人工合成的DNA探针;分析点突变5·锁式探针

一种特别设计的DNA探针，中间为连接序列6·实时定量PCR探针

二、探针标记物

(一)放射性同位素标记物(32P、2H和32S)极高的灵敏度和特异性放射性污染,半衰期短,昂贵(二)非放射性标记物(生物素、地高辛和荧光素等)实验周期短;稳定性好,标记探针可以长时间存放备用;无放射性污染灵敏度和特异性有时不理想三、探针标记法1、体内标记：将放射性化合物加入培养基，由细胞吸收之后经过合成代谢掺入新合成的核酸分子2、体外标记（最常用）：化学法和酶促法化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团进行交联，将标记物直接结合到探针分子上。简便快速、标记均匀酶促法：先用标记物标记核苷酸，再通过酶促反应将标记核苷酸掺入探针分子，或将标记基团从核苷酸转移到探针分子

(一)切口平移标记法

(二)随机引物标记法

末端标记法(三)聚合酶链反应标记法一种标记dNTP和三种普通dNTP为底物，短链探针(四)末端标记法T4多核苷酸激酶、末端转移酶、Klenow片段和T4DNA聚合酶

四、探针纯化1·乙醇沉淀法

DNA片段可以被无水乙醇沉淀操作简便，首选方法2·凝胶过滤法

利用凝胶的分子筛特性凝胶填料是SephadexG-50和Bio-GelP-60第三节固相支持物与印迹

一、固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和活化滤纸1·硝酸纤维素膜结合量大、本底较低、操作简便结合力不强，碱性、真空烘烤破裂变脆2·尼龙膜韧性较强，不易破裂中性尼龙膜和正电荷修饰尼龙膜二、印迹方法

第四节常用核酸印迹杂交技术

常用的核酸分子杂交技术多为固相杂交根据操作方法的不同分为印迹杂交：将凝胶电泳的高分辨率与核酸分子杂交的高灵敏度相结合，包括DNA印迹法和RNA印迹法等原位杂交：包括组织原位杂交法及菌落杂交法、噬菌斑杂交法等核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针一、DNA印迹法

1.样品制备；2.电泳分离；3.变性；4·印迹；5·固定；6·预杂交；7.杂交；8·洗膜；9·分析放射自显影照片二、RNA印迹法

RNA印迹法分析的待测核酸是RNA与DNA印迹法基本一致，所不同的是:

①为了保持RNA呈单链状态进行电泳，以使RNA按分子大小分离，需要先用变性剂将RNA样品完全变性，再电泳分离

②RNA样品只能用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜(DMSO)等变性，不能用碱变性，因为碱会导致RNA降解。RNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一特定RNA，特别是分析mRNA的大小和含量，从而研究基因表达。避免RNase污染，包括抑制内源性RNase的活性三、斑点杂交法和狭缝杂交法将粗制或纯化的DNA或RNA样品变性之后直接点于固相膜表面，经过固定、预杂交之后与过量探针进行杂交分析印迹:圆斑(dot),短线(slot)用于检测DNA样品的同源性、细胞内特定基因的拷贝数和基因表达情况优点:用样量少，操作简便，不电泳和转移，在同一张固相膜上可以分析多个样品缺点:特异性不高,不能分析样品的分子量

斑点杂交和狭缝杂交制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样）优点：简便、快速、灵敏、样本用量少缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性四、组织原位杂交(insituhybridization)把组织切片进行适当处理，增加细胞膜的通透性，然后置于含探针的杂交液中，使探针进入细胞内，与DNA或RNA杂交以cDNA为探针检测与其互补的mRNA在细菌或其他真核细胞中的位置，称为RNA原位杂交，是分析基因表达的常用方法不需提取核酸，保持组织和细胞的形态，分析待测核酸的组织、细胞、亚细胞甚至染色体定位分析特定基因表达情况、病原体的存在部位和方式荧光原位杂交(FISH)是用荧光素标记探针进行的原位杂交①灵敏、稳定、安全、直观②多色荧光原位杂交可以同时分析多种靶序列荧光标记探针检测精子五、菌落杂交和噬菌斑杂交

六、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)

ASOH：最早检测已知点突变，目前广泛采用的基因诊断方法关键：设计一对ASO，长度15-20nt，只有一个碱基不同，对应突变位点（正常探针，突变探针）诊断遗传病，例如诊断苯丙酮酸尿症(PKU)，根据某个突变位点(例如Arg243Gln)设计一对探针:用两种探针分别和待测DNA杂交，显性纯合子只与正常探针杂交，杂合子与正常和突变探针都杂交，隐性纯合子只与突变探针杂交，因此根据杂交结果可以判断待测个体的基因型苯丙酮酸尿症患者基因型是隐性纯合子第五节影响杂交的因素

核酸分子杂交的效果取决于杂交的特异性和杂交的效率1·核酸分子大（↓）小和浓度（正相关）发生碰撞才可能杂交2·探针种类和浓度：单链探针杂交效率会随着浓度的增加而提高，双链探针与此相反3·杂交温度：最适杂交温度(比解链温度低20-25℃时)；特异性4·↓离子强度和↑甲酰胺浓度：↓最适杂交温度5.杂交时间：控制在20小时左右6·杂交促进剂:＞250nt探针杂交用惰性多聚体(硫酸葡聚糖/PEG)7.非特异性杂交：预杂交，即用封闭物（变性的非特异性DNA、高分子化合物）封闭非特异性杂交位点第六节蛋白质印迹法蛋白质印迹法可以用于定性和半定量分析混合物中的蛋白质综合了聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高和固相免疫分析特异性高、灵敏度高等优点一、基本内容

二、注意事项1·选用合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度2·印迹时，应选用小孔径的固相膜，以免小分子量蛋白质透过固相膜丢失3·蛋白质印迹法检测信号的强弱受多种因素的影响，所以一般只用于半定量分析即测定目的蛋白的相对含量，确定该目的蛋白是否存在，比较其在不同细胞内的含量不同目的蛋白用不同抗体检测时，分析结果没有可比性三种印迹技术的比较第七节生物芯片

定义：也称为生物微阵列，是指通过微电子、微加工技术，用生物大分子

(例如核酸、蛋白质)或细胞等在数平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统，用以对生物组分进行快速、高效、灵敏的分析与处理种类：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、微流控芯片和芯片实验室

固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龙膜等特点：高通量、集成化、标准化和微型化

一、基因芯片（genechip）

DNA芯片、DNA微阵列、寡核苷酸微阵列定义:是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA探针以点涂的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的信号（即基因序列或表达的信息）基本原理依然是基于核酸分子杂交，属于固相杂交不同：探针固相化、集成化并且不标记;而待测样品游离于液相并且被标记

基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray

(一)基本原理和基本操作

基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的高通量检测DNA的技术基本操作分为四个步骤芯片制作样品制备分子杂交检测分析1·芯片制作一个复杂而精密的过程，需要专门的仪器(1)原位合成法:光引导原位合成法分子印章法(2)微量点样法:喷墨打印（微孔）接触打印（点样针）2·样品制备待测样品（Cy3）；对照样品（Cy5）3.分子杂交探针含量远多于待测DNA含量（杂交信号强弱与待测DNA含量成正比）优化杂交条件：离子强度、温度、时间4、检测分析以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上DNA探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来DNA芯片技术流程大规模基因芯片的应用

(二)应用

基因芯片技术的主要用途是进行DNA测序和研究基因表达在这两种用途的基础上，基因芯