微生物与酶制剂工业

第十章微生物与酶制剂工业本章内容第一节酶的生产方法第二节酶生物合成的基本理论第三节微生物发酵产酶工艺（重点）第四节酶发酵动力学纤维素燃料乙醇“酶”好时代秸秆、树叶，这些在很多人眼中称之为‘废料’的东西，其实都是宝贝。他们甚至可以成为车用燃料。而酶就像是打开生物世界的钥匙，通过它的催化作用，能够将植物废料中的植物纤维转化为糖，然后再经发酵制成为乙醇。将这些乙醇添加到燃料中，能够降低石油燃料的消耗，减少有害物质的排放，我们把这种用非粮食作物生产出来的乙醇称之为第二代燃料乙醇。第一节酶的生产方法一、酶的生产方法1、提取法

采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的限制。2、化学合成法

是20世纪60年代中期出现的新技术。只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。目前仍然停留在实验室内合成的阶段。3、微生物发酵法

是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称为发酵法。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。1、微生物种类多，酶种丰富；2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶；3、微生物培养基来源广泛，价格便宜；4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程；5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。二、应用微生物来开发酶的优点三、酶发酵生产的类型1、液体深层发酵：液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。2、固体培养发酵培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。第二节酶生物合成的基本理论一、酶生物合成的过程DNARNA蛋白质（新生多肽链）成熟蛋白质（酶）转录翻译加工二、酶生物合成的调节

按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：组成酶—恒定（速度、浓度）诱导酶—在外界环境因素诱导下合成速度急增，酶浓度成百上千倍增加酶合成的调控类型：诱导和阻遏1、酶合成的诱导作用

加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用。诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。

例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成淀粉诱导α-淀粉酶的合成2、酶合成的阻遏（1）终产物阻遏

指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。（2）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。

葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶第三节微生物发酵产酶工艺

发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后由发酵所得物料制成酶产品。

现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。无论哪种发酵法，都要做三方面的工作：（1）从原料准备培养基；（2）从原始菌种准备生产菌种；（3）发酵过程管理。一、发酵产酶的一般工艺流程酶发酵生产的一般工艺流程图保藏菌种

试管斜面培养（活化）摇瓶扩大培养种子罐培养发酵罐分离纯化酶培养基无菌空气二、产酶菌种（一）产酶菌种的要求（1）产酶量高；（2）繁殖快，发酵周期短；（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；（5）最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。（6）安全性可靠，非致病菌。（二）常用的产酶微生物大肠杆菌

谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。1、细菌直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。枯草芽孢杆菌链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。2、放线菌黑曲霉：糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。红曲霉：α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。木霉：纤维素酶。根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。毛霉：蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶3、霉菌啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。4、酵母

工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源酶产酶微生物用途α-淀粉酶枯草芽胞杆菌地衣芽胞杆菌米曲霉淀粉液化，织物退浆，消化助剂，加酶洗涤剂葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米根霉制造葡萄糖，发酵、酿酒等工业的淀粉水解糖中性蛋白酶枯草芽胞杆菌，米曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，调味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清碱性蛋白酶地衣芽胞杆菌加酶洗涤剂植酸酶黑曲霉，毕赤酵母工程菌株饲料添加剂纤维素酶里氏木霉、黑曲霉水洗布生产，饲料添加剂，消化植物细胞壁半纤维素酶木霉、曲霉、根霉饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产β-葡聚糖酶枯草芽胞杆菌，黑曲霉，Penicilliumemersonii啤酒酿造，饲料添加剂异淀粉酶产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉乳品工业（处理牛乳和乳清）果胶酶曲霉、欧文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻类纤维脱胶

工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源转化酶啤酒酵母、假丝酵母制造转化糖凝乳酶米赫毛霉,大肠杆菌和真菌生产的重组酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖葡萄糖异构酶凝结芽胞杆菌，白色链霉菌生产果葡糖浆青霉素酰化酶细菌、霉菌、放线菌制造6-氨基青霉烷酸

工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源（三）生产菌种的来源1、菌种保藏机构向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。

2、筛选由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。（1）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等；产酶菌种筛选步骤：（2）初筛：分离产目的酶的菌株；给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。-淀粉酶的筛选（3）复筛：从所得菌株中筛选优良株在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。诱变育种细胞杂交原生质体融合育种基因工程育种（4）高产菌株的选育（四）产酶菌种的保存

保藏方法：斜面保藏法，沙土保藏法，真空冷冻干燥保藏法，低温保藏法，石蜡油保藏法等（五）生产种子的制备生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用于发酵罐接种的大量菌体。1、种子制备工艺过程（1）菌种活化

目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力。方法：在试管斜面上培养1-3代。（2）扩大培养

目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。培养基称为种子培养基。方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。

（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性；（2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐；（4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。扩大培养应注意的事项：三、培养基

碳源、氮源、无机盐、生长因子、水等。

培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养物质的混合物。1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜4、经济节约微生物发酵产酶培养基举例1、枯草杆菌BF7658α-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%

豆饼粉4%

磷酸氢二钠0.8%

硫酸铵0.4%

氯化钙0.2%

氯化铵0.15%

自然pH2、黑曲霉糖化酶发酵培养基

玉米粉10%

豆饼4%

麸皮1%pH4.4~5.0四、发酵条件的控制—影响产酶的几个重要条件1、温度的调节控制（2）有些微生物生长最适温度与发酵产酶的最适温度有所不同。例：酱油曲霉生产蛋白酶，28℃时蛋白酶产量比在40℃条件下高2~4倍，在20℃条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生长速率较慢。

为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。（1）不同的微生物有不同的最适生长温度。（3）温度的控制方法

一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。2、pH值的调节控制（1）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。（2）微生物生长的最适pH值与产酶最适pH值往往不同。3、溶解氧的调节控制

溶解氧指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶解氧。调节溶氧速率的方法（1）调节通气量；（2）调节氧的分压；（3）调节气液接触时间；（4）调节气液接触面积；（5）改变培养液性质。5、湿度的调节控制

用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。4、泡沫形成：通气搅拌、培养基中某些成分的变化、代谢产生的气体。危害：阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；引起染菌。消泡方法：机械消泡、化学消泡。五、提高酶产量的措施A添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。1)通过条件控制提高酶产量B控制阻遏物的浓度1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。C添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。D添加产酶促进剂

产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的产量。2)通过基因突变提高酶产量突变：是指生物的遗传性状发生变异，以致影响了生物的正常遗传，可遗传的基因突变发生在结构基因上，往往导致酶的结构和性质发生改变：基因突变引起酶产量提高的方式：

1.诱导型组成型

2.阻遏型去阻遏型3）通过体内基因重组提高酶的产量体内基因重组包括少数或者个别基因的重组，主要通过接合、转导、转化等方法进行；也包括整个染色体的重组，主要的途径是原生质体融合4）通过体外基因重组提高酶的产量第四节酶发酵动力学

研究发酵过程中细胞生长速度,产物生成速度及环境因素对这些速度的影响。酶发酵动力学研究意义:了解酶生物合成模式；发酵工艺条件优化控制；提高酶产量。一、微生物生长曲线

（Microbialgrowthcurve）迟缓期对数生长期稳定生长期衰亡期时间细胞数量的对数二、酶的生物合成模式（1）同步合成型（2）中期合成型（3）延续合成型（4）滞后合成型酶的生物合成模式可发分为4种类型：1、同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行，又称生长偶联型。特点：（1）发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。（2）生长至稳定期后，酶浓度不再增长。2、中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而进入稳定生长期后，酶的合成也终止。特点：（1）该类酶的合成受分解代谢物阻遏。（2）该酶对应的mRNA不稳定。3、延续合成型酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入稳定期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。特点：（1）该类酶不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。（2）该酶对应的mRNA是相当稳定的。4、滞后合成型只有当细胞生长进入稳定期后，酶才开始合成。又称非生长偶联型。特点：（1）该类酶受分解代谢物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。（2）该酶对应的mRNA稳定性高。

选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。

改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件：（1）同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。（2）中期合成型：要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力。（3）滞后合成型在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。选择与改造三、细胞生长动力学细胞生长动力学主要研究细胞生长速度及外界因素对其影响的规律。在发酵过程优化及发酵过程控制等方面具有重要的应用价值。Monod认为，在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比：Rx=dXdt=μXRx—生长速率，单位时间内细胞浓度的增加值，mg/mL·min，g/L·hX—细胞浓度，mg/mL，g/Lμ—比生长速率，生长速率与细胞浓度之比（单位细胞在单位时间内浓度增加值），h-1若培养基中只有一种限制性基质时，μ为此限制性基质浓度的函数：微生物生长动力学模型（后人称Monod方程）：μ

=μmax·SKs+SS—限制性基质浓度，mol/L，g/Lμmax—最大比生长速率，限制性基质浓度过量时的比生长速率Ks—Monod常数，μ=1/2μmax时，Ks=S限制性基质：指对发酵起决定性作用的基质成分，通常是碳源物质。只考虑限制性基质，可简化数学分析。Monod方程是基本的细胞生长动力学方程;从不同情况出发对其进行修饰.

连续全混流反应器发酵过程中,稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程:D=0时,分批发酵;D<μ

时,细胞浓度增加;D=μ

时,细胞浓度恒定;D