第03章酶催化作用机制

第三章酶催化作用机制

一、酶的作用机制相关学说二、酶反应的高效催化机制三、酶促反应动力学一、酶的作用机制相关学说关于酶的作用机制有多种学说。这些学说有一些共同的特点：1.酶的活性中心是酶表现专一性的基础，不仅要求结合基团与催化基团的存在，而且要求他们有特定的构象分布；2.酶要表现作用必须通过它和底物结合。(一)酶的刚性与“琐和钥匙”学说

1890年，德国化学家费舍尔（Fisher）提出了著名的“琐和钥匙”学说。此学说认为：酶与底物都是刚性的，二者结构间天然存在互补的关系，就像锁和钥匙一样。此学说较好的解释了酶对底物选择的专一性，但不能解释酶能够高效催化反应的原因。1902年，亨利(Henri)中间产物学说。即：E+S＝ES＝E+P过渡态中间产物的形成使反应的活化能大幅降低。

(二)酶的柔性与“诱导契合”学说1958年，考施兰德（Koshland）首先认识到底物的存在可能会诱导酶活性中心发生一定程度的构象变化。提出了著名的“诱导契合”学说。此学说认为：酶分子的构象不是一成不变的，而是在底物分子临近酶分子时，酶分子受到底物的诱导，其构象会发生某些变化，使之有利于与底物结合。二.酶作用高效率的机理邻近效应和定向效应构象变化效应酸碱催化机制共价催化机制金属离子的催化活性中心的低介电性——微环境效应

协同催化邻近效应是指底物结合于很小体积的活性中心后，使活性中心的底物浓度得以极大的提高，并同时使反应基团之间互相靠近，提高了反应速度。定向效应(orientationeffect)是指底物的反应基团与催化基团之间或底物的反应基团之间正确地取向所产生的效应。（一）邻近效应和定向效应邻近和定向效应的作用：(1)由于酶与底物的趋近与定向效应，底物分子在酶活性中心附近的浓度升高，而使反应速度加快。(2)由于酶与底物之间的趋近和定向效应，酶活性中心上的基团对底物分子具有轨道导向作用，因而减少反应所需的活化能。(3)由于酶与底物的趋近和定向效应，生成中间产物，可使分子间反应变成分子内反应，从而提高反应速度。(4)酶与底物的趋近和定向效应生成中间产物ES，经测定ES的寿命为10-7～10-4s，而两个分子随机碰撞而结合的平均寿命为10-13s，前者是后者的106～109倍，使酶催化反应的几率显著增加，反应效率更高。这种作用称为底物的固定作用(substrateanchoring)。（二）底物分子形变或扭曲当酶分子与底物分子互相接近时，由于两者的相互作用，酶分子和底物都会发生构象变化，从而有利于酶与底物的结合，这种作用称为构象变化效应。1.底物诱导酶分子构象的改变2.酶分子诱导底物构象的改变1.底物诱导酶分子构象的改变1958年，柯施兰德提出诱导契合学说，他认为酶分子的构象不是一成不变的，而是在底物分子临近酶分子时，酶分子受到底物的诱导，其构象会发生某些变化，使之有利于与底物结合。2.酶分子诱导底物构象的改变

当酶分子邻近底物时，底物为了能和酶的活性中心更好的结合，在酶分子的诱导下，产生各种类型的扭曲变形和构象变化，更近似过渡态结构，使反应所需的活化能大大降低，因而加速反应的进行。(三)酸碱催化机制

酶的催化作用是酶和底物分子之间通过质子（H+）传递作用，即酸和碱的相互转变，而降低反应所需的活化能，使反应加速进行。这种催化理论称为酸碱催化机制。酶蛋白中的酸碱催化基团是由氨基酸残基上的侧链提供的，酸碱催化基团中，以咪唑基最为常见。(四)共价催化机制

在酶催化过程中，首先酶与底物形成一种中间复合物。这种中间复合物是由于酶的某些基团攻击底物的某些特定基团而形成的共价中间产物。这种催化理论称为共价催化机制。共价催化可分为亲核催化和亲电催化两类。

（五）金属离子的催化作为辅基或激活剂调节氧化还原反应稳定或屏蔽电荷传递电子(六)活性中心的低介电性

——微环境效应

微环境效应的概念：微环境是指酶的活性中心上的催化基团所处的一种特殊的疏水反应环境。由于酶分子活性中心的催化基团处于特殊的疏水反应环境影响与底物的结合，并影响催化基团的解离，使反应加速进行，这种作用称为微环境效应。许多有机化学反应会受到其溶剂环境的影响。例如，叠氮盐与对硝基氟苯的反应在二甲基亚砜中进行时的速度比在水中进行时快12000倍。通过X射线衍射研究，发现许多酶分子的活性中心往往有一个与水溶液有显著不同的环境。如胰凝乳蛋白酶和溶菌酶。（七）协同催化某一酶的催化中并不只有一种效应，而往往是多种效应共同存在，这些效应协同作用。三、酶促反应动力学概念酶促反应动力学是研究酶促反应速度以及影响酶促反应速度的各种因素，并加以定量的阐述的一门科学。影响因素包括有底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。在其他因素不变的情况下，底物浓度对酶促反应速度的影响呈矩形双曲线关系。(一)底物浓度对反应速度的影响当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比。[S]VVmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度，说明酶已经被底物所饱和。[S]VVmax1.

米氏方程1913年，米彻利斯(Michaelis)和曼吞（Menton)在前人研究的基础上，推导出著名的米氏方程：

v——反应速度；S——底物浓度；vm——最大反应速度；Km——米氏常数，为酶催化反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度。中间产物学说中间产物酶促反应速度与底物浓度的关系，可以用中间产物学说加以解释。酶促反应模式——中间产物学说E+S

k1k2k3ESE+P米－曼氏方程式推导基于两个假设：E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即

V＝k3[ES]。(1)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。（t代表初始）推导过程稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即[ES]恒定。K1([Et]－[ES])[S]＝K2[ES]+K3[ES]K2+K3＝Km

（米氏常数）K1令：则(2)变为:([Et]－[ES])[S]＝Km[ES](2)＝([Et]－[ES])[S]K2+K3[ES]K1整理得：代表中间产物的稳定性当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度Vmax＝K3[ES]＝K3[Et](5)[ES]＝───[Et][S]Km+[S](3)整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：Vmax[S]Km+[S]V＝────将(3)代入(1)得K3[Et][S]Km+[S](4)V＝────当反应速度为最大反应速度一半时（1）

Km值的数值∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。Km＝[S]2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2（2）Km与Vmax的意义Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。单位与底物浓度一样。②意义：a)

Km是酶的特征性常数之一；b)

Km可近似表示酶对底物的亲和力；c)

同一酶对于不同底物有不同的Km值。d)已知Km值情况下，应用米氏方程可计算任意底物浓度时的反应速度，或由所要求的反应速度求出应当加入底物的合理浓度。

实际用途：1）可由所要求的V求[S]；练习题：求反应速度达最大反应速度99%时的底物浓度？（用Km表示）2）根据已知[S]求该反应V。练习题：已知某酶的Km值为0.05mol/L，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？

Vmax（Vm）定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知，可从Vm计算动力学常数K3。（3）Ｋm值与Ｖmax值的测定

基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。1）双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法

Vmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数VmaxV[S]KmVmax/2酶动力学的双倒数图线2）Hanes作图法[S][S]/V-Km

Km/Vm在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/VmaxEadie-HofsteeplotHanesplotCornish-BowdenplotDixonplot定义—当酶被底物充分饱和时，单位时间内（每秒钟）每个酶分子催化底物转变为产物的分子数（微摩尔数）。意义—可用来比较每单位酶的催化能力。

酶的转换数（二）酶浓度的影响

在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比，如图1—3所示。它们之间的关系可以用下列数学式表示：v＝k3[E]（三）

温度的影响每一种酶的催化反应都有其有效温度范围和最适温度。在有效温度范围内，酶才能够进行催化反应；在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大（四）pH值的影响酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系。每一种酶都有其各自的有效pH值范围和最适pH值。只有在有效pH值范围内，酶才能显示其催化活性，在最适pH值条件下，酶催化反应速度达到最大（五）抑制剂的影响

能够使酶的催化活性降低或者丧失的物质称为酶的抑制剂。抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂之分。1.不可逆抑制

不可逆抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。不可逆抑制作用又可以分为非专一性不可逆抑制和专一性不可逆抑制两种。

（1）非专一性不可逆抑制非专一性不可逆抑制剂作用于酶分子中一类或几类基团。如果被作用的基团属于必需集团，或者作用后引起酶分子活性中心结构不可逆转的改变，则导致酶的不可逆抑制。不可逆抑制剂主要有：汞、银、铅等重金属离子，有机磷、有机砷、有机汞、氰化物、硫化氢化合物，酰基化试剂，烷基化试剂，巯基乙醇等。（2）专一性不可逆抑制专一性不可逆抑制剂是根据酶的底物结构和催化机制，专门设计的只对某一种酶起不可逆抑制作用的化合物。又称为亲和标记试剂。结合型和催化型不可逆抑制专一性不可逆抑制又可以根据其作用机制不同分为结合型(Ks型)不可逆抑制和催化型(Kcat型)不可逆抑制两种。（1）结合型不可逆抑制Ks型不可逆抑制是指抑制剂只能专一地与某种酶结合而引起的不可逆抑制作用。对某种酶具有结合型不可逆抑制作用的化合物称为Ks型不可逆抑制剂，这类试剂是根据底物的结构特点而设计的。具有与酶作用底物类似的结构，可以与酶专一地结合，同时还具有一个可以与酶活性中心的某个必需基团反应，而使酶失活的基团。

（2）

催化型不可逆抑制催化型(Kcat型)不可逆抑制是指抑制剂能专一地与某种酶结合并发生催化反应，而反应的产物中含有一个基团可以与酶分子活性中心的基团共价结合，导致酶分子不可逆地丧失催化活性。2.

可逆性抑制可逆性抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。根据可逆性抑制作用的机理不同，酶的可逆抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。（1）竞争性抑制

竞争性抑制(competitiveinhibition)是指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。竞争抑制.swf竞争性抑制剂与酶作用底物的结构相似。它与酶分子结合以后，底物分子就不能与酶分子结合，从而对酶的催化起到抑制作用。例如丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。22+++EESIESEIEP+IEIE+SE+PES反应模式竞争性抑制的效果强弱与竞争性抑制剂的浓度、底物浓度以及抑制剂和底物与酶的亲和力大小有关。随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。竞争性抑制的特点是酶催化反应的最大反应速度vm不变，而米氏常数Km增大许多代谢类似物都是竞争性抑制剂，可用作抗菌药和抗癌药物。抗癌药:氨基叶酸、阿拉伯糖胞苷、5-氟尿嘧啶等。青霉素青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。竞争性抑制作用举例某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用药物（抑制剂）被抑制的酶竞争底物临床应用及机理磺胺药二氢叶酸合成酶（细菌）苯甲酸抗菌作用（抑制四氢叶酸）氨基蝶呤二氢叶酸还原酶二氢叶酸抗白血病5-氟尿嘧啶（5-FU）尿嘧啶核苷磷酸化酶（胸腺嘧啶核苷磷酸化酶）尿嘧啶（胸腺嘧啶）抗癌作用（抑制核苷酸合成）别嘌呤醇黄嘌呤氧化酶黄嘌呤，次黄嘌呤抗痛风（抑制尿酸生成）6-氨基已酸纤溶酶-赖氨酸-氨基酰止血，抗纤溶（抑制纤溶酶）苯丙胺（麻黄素）单胺氧化酶肾上腺素（去甲肾上腺素）中枢兴奋，抗哮喘竞争性抑制剂与磺胺类药物磺胺类药物，如对氨基苯甲酸的结构类似物，可竞争性抑制细菌的二氢叶酸合成酶活性，从而达到抑菌效果。蝶呤对氨基苯甲酸Glu二氢叶酸合成酶二氢叶酸四氢叶酸嘌呤核苷酸二氢叶酸还原酶一碳单位磺胺类药物磺胺类药物的抗菌机理：TMP过渡态类似物作为竞争性抑制剂（2）非竞争性抑制非竞争性抑制(noncompetitiveinhibition)是指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而引起酶活性降低的抑制作用。由于非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合，所以，抑制剂的分子结构可能与底物分子的结构毫不相关。增加底物浓度也不能使非竞争性抑制作用逆转。*反应模式E+SESE+P+

S－S+

S－S+ESIEIEESEP+IEI+SEIS+I非竞争性抑制的特点是最大反应速度vm减小，而米氏常数Km不变，如图1-7所示。非竞争性抑制的Km和vm变化（3）反竞争性抑制

在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用称为反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)。*反应模式E+SE+PES+IESI++ESESESIEP反竞争性抑制的特点是最大反应速度vm和米氏常数Km同时减小，如图l—8所示。

酶活性抑制作用的分类（六）激活剂的影响能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质称为酶的激活剂或活化剂。在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶原生成有催化活性的酶。（1）无机离子激活剂Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+等金属离子和Cl-、Br-、I-等无机负离子。例如，(Ca2+)是α-淀粉酶的激活剂，钴离子(Co2+)和镁离子(Mg2+)是葡萄糖异构酶的激活剂等。（2）小分子有机化合物抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽对某些含巯基的酶有激活作用，如3-磷酸甘油醛脱氢酶。另外，乙二胺四乙酸（EDTA）是金属离子螯合剂，能解除重金属离子对酶的抑制作用，也可视为激活剂。（3）生物大分子激活剂有的酶也可以作为激活剂，通过激活剂的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性显示出来。例如，胰蛋白酶原可在肠激酶和胰蛋白酶的作用下，除去一个六肽，从而显示出胰蛋白酶的催化活性。胰蛋白酶激活第四节

酶的活力测定在酶学和酶工程的研究和生产中，经常需要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少以及变化情况。酶活力测定是在一定条件下测定酶所催化的反应速度。在外界条件相同的情况下，反应速度越大，意味着酶活力越高。酶催化反应速度用单位时间(t)内底物的减少量(S)或产物的增加量(p)表示。一.酶活力测定的方法酶活力测定的方法多种多样，如化学测定法、光学测定法、气体测定法等。总的要求是快速、简便、准确。酶活力测定均包括两个阶段。首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。一般经过如下几个步骤：酶活力测定的一般步骤(1)根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。(2)根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。(3)在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。(4)反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。测定反应液中底物的减少或产物的生成量，可采用化学