新疆人ACEApoE以及HLA-DRB基因多态性与长寿的关系,医学遗传学论文

新疆人ACE，ApoE以及HLA-DRB基因多态性与长寿的关系,医学遗传学论文国际自然医学会将新疆和田地区列为世界四大长寿区之一，和田的长寿人群称之为自然长寿人群。这一特殊人群为鉴定长寿的相关基因、研究遗传因素与长寿的关系提供了一个理想的模型。研究表示清楚，除了健康生活方式和良好饮食习惯外，基因差异可能也是长寿的影响因素之一。长寿一般都无一导致大多数成年人死亡的主要疾病，例如心血管病、糖尿病、老年痴呆症和癌症等，这为我们寻找与长寿相关基因提供了线索。本研究旨在讨论新疆和田地区维吾尔族自然长寿人群中ACE，ApoE以及HLA-DRB基因多态性与长寿的影响及互相关系，报告如下。对象与方式方法一、一般资料选择新疆和田地区90岁的维吾尔族自然长寿老人144例〔长寿组〕，平均年龄95.53岁；选择同地区，年龄60~70岁者69例为老年组，平均年龄为66.71岁；选择以同一地区相互无血缘关系的已自然死亡的61~73岁者52例〔家族史中无寿命大于80岁者〕为对照组，平均年龄为67.60岁。年龄标准：人寿保险公司提供百岁老人名单；逐村逐户走访，以四代人为基础；按4次重大历史事件〔1902年第1次鼠疫大流行事件；1912～1913年第2次鼠疫发生；1936年回民战争；1952年土地改革〕推定年龄，一般为6岁无记忆，12岁开场记忆，结婚年龄为15岁，能参军打仗年龄为18岁。按此基本知识推断再与1981年户籍对照，误差5岁；三查三对，不同的医师进行核对，不得出现矛盾；实际年龄参考公式=0.45(自报年龄)十50，实际年龄和自报年龄误差不超过3岁。二、方式方法1.人基因组DNA提取：在知情同意的前提下，抽取静脉血5ml，EDTA抗凝，低渗法破红细胞，分离白细胞，基因组DNA采用酚/氯仿抽提的方式方法，纯度为A260：A2801.8。2.PCR-SSP法扩增HLA-DRB等位基因：PCR反响体系：在0.5mlEp管中依次参加下面试剂，dNTP1l，10缓冲液2.5l，DNA聚合酶(上海复华生物技术有限公司提供)0.5U，消毒去离子水16.5l，5引物及3引物各1l，模板DNA1l用石蜡油覆盖，离心混匀，进行扩增，取PCR产物10l电泳，于紫外灯下观察。3.ACE基因多态性检测：目的片断扩增参照Rigat的方式方法设计一对引物，PCR反响终末体积为25l〔华而不实包括模板DNA1l，两种引物分别为2pmol，MgCl2终浓度为2mmol/L，KCl终浓度为50mmol/L，Tris-HCl终浓度为10mmol/L〔pH8.0〕，Taq酶0.5U〕进行扩增，取PCR扩增产物10l电泳，于紫外灯下观察结果，根据扩增片段长度确定其基因型别。4.单链构象多态性〔SSCP〕分析：取PCR扩增产物，经变性后电泳，硝酸银染色分析电泳结果。将不同带型标本测序，确定变异碱基及其位置〔测序由北京华大中生科技公司完成〕。5.ApoE基因型检测：以下为参考文献[3]设计合成一对引物〔由上海生工合成〕。PCR反响终末体积为25l，采用美国PTC-100型PCR扩增仪进行扩增。取PCR产物10l加10UHhaI内切酶，37℃酶切3h。用8%聚丙烯酰胺凝胶于200V恒压下垂直电泳3h，银染，据获得的6种酶切图谱，判定apoE基因型。三、统计学方式方法应用SPSS17.0统计软件。各基因型频率采用直接计数法。基因频率=阳性基因数/样本数2〔而HLA-DRB51,DR52,DR53阳性率=阳性基因数/样本数〕。研究对象能否符合Hardy-Weinberg平衡用掊2检验；HLA-DRB、ACE基因I/D多态性及ApoE基因分布，3组间基因型及等位基因频率比拟用RC表掊2检验。结果一、临床特点本研究中患者均具体询问病史、查体及行实验室检查；测量身高、体重、血压。实验室检查包括测定血胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和血糖水平。结果显示，长寿组与老年组体质指数〔BMI〕间比拟其差异有统计学意义〔P0.01〕，长寿组和老年组之间收缩压和舒张压的比拟差异有统计学意义〔P0.05〕；长寿组与对照组间收缩压的比拟差异有统计学意义〔P0.01〕；3组间低密度脂蛋白比拟差异有统计学意义〔P均0.05〕，见表1。二、HLA基因型的频率分布长寿组HLA-DR1，DR6〔14〕基因频率较对照组升高〔P＜0.05〕，与老年组比拟差异无统计学意义；长寿组HLA-DR9频率较对照组降低〔P＜0.05〕，较老年组显著降低〔P＜0.01〕；长寿组HLA-DR51基因频率较老年组降低〔P＜0.05〕，与对照组比拟差异无统计学意义。其余各型基因频率3组间比拟差异无统计学意义〔表2〕。三、ACE基因型和等位基因频率的分布长寿组D/D基因型频率较对照组显著升高〔P0.01〕，与老年组比拟也有显著升高〔P0.05〕；长寿组D等位基因频率亦显著高于对照组〔P0.05〕，与老年组比拟差异无统计学意义；另外，3组间DI、Ⅱ基因型比拟其差异均无统计学意义，见表3。四、ApoE基因型和等位基因频率的分布ApoE基因有6种不同的基因型。长寿组ε3/3基因型频率较老年组升高〔P0.05〕，与对照组比拟无明显差异；长寿组ε4/3基因型频率较对照组明显降低〔P0.001〕，较老年组也显著降低〔P0.01〕；余基因型比拟其差异无统计学意义。大样本群体调查发现ApoE基因型及等位基因频率分布存在明显种族差异。该研究结果显示，ε3/3基因型也是维吾尔族的主要基因型，而ε3等位基因频率介于白人和汉族人之间，表现出微弱种族差异性，见表4。讨论人类白细胞抗原〔humanleukocyteantigen,HLA〕是人类基因组的一个重要组成部分，蕴藏着丰富的遗传信息，与机体免疫，疾病与肿瘤的发生、发展有密切的关系。本次研究中，长寿组HLA-DR1，DR6〔14〕基因频率高于对照组，而HLA-DR9，DR51基因频率明显低于老年组，考虑HLA-DR1、DR6〔14〕基因可能是长寿有利基因，而HLA-DR9，DR51基因可能是长寿的危险因素。Takata等于20世纪90年代检测了日本著名的长寿宫82例百岁老人〔100~106岁〕、20例长寿老人〔90~99岁〕，其对照组为159例同一地区的成年人，并各组分析了HLA基因频率。结果为百岁老人组HLA-DRw9基因频率为8.5％，长寿组为5.0％，而对照组则为30.8％。在HLA-DR1出现频率又有不同，百岁老人6％，长寿老人10％，而对照组0.63％。故提出HLA是决定人类寿命基因之一。Henon等研究了336例百岁以上退伍老兵和102例90岁以上的随机选自家庭的长寿老人，得出HLA-DR11分子的保卫效应，充分地表现了免疫易感基因优势，有力地证明了HLA-DR11基因的长寿效应。Akisaka等报道HLA-DR9在日本冲绳百岁老人中的频率很低，是长寿的危险因素，HLA-DR1则表现很高的频率而被以为是有利因素。Lio等对撒丁岛地区120例长寿老人和86例当地对照组进行研究，未发现HLA-DRB1各等位基因频率间存在明显差异。血管紧张素转换酶〔angiotensin-covertingen-zyme,ACE〕基因位于人染色体17q23区，在第16内含子中含有287bp的插入/缺失多态性。当前以为ACE基因插入/缺失〔I/D〕多态性与心脑血管疾病有密切关系，而研究证实ACE基因I/D多态型与长寿有密切关系。本研究中长寿组DD基因型频率明显高于其余2组，D等位基因频率高于对照组，讲明DD基因型和D等位基因是长寿的有利基因。Faure等研究发现法国百岁老人组D型等位基因频率明显高于对照组，D型等位基因频率在百岁组中更为常见。Davide等研究发现，意大利百岁老人中D/D基因型频率及D型等位基因频率明显高于对照组。而一项对欧洲人的研究讲明，80岁以上老年组的ACEDD基因型和D等位基因频率高于对照组，讲明ACEDD基因型和D等位基因有助于健康和长寿。而在我们国家对广西巴马壮族长寿人群的调查中同样发现，ACE基因的D/D基因型和D型等位基因与巴马老人自然长寿有关，可能有利于长寿或其与长寿关联的可能性大，而I/I型很可能不利于长寿或阻碍长寿。载脂蛋白E〔apolipoproteinE,ApoE〕位于19号染色体上，具有6种表现型和3种等位基因。研究显示，ApoE基因多态性与长寿、心血管疾病、老年痴呆等均有相关性。尽管在不同的人群中其基因型与长寿关系不同，但在多个群体的证实ApoE是公认的长寿相关基因。本组研究中，长寿组ε3/3基因型频率较老年组升高〔P0.05〕，可能是有利于长寿基因；长寿组ε4/3基因型频率较对照组明显降低〔P0.001〕，较老年组也显著降低〔P0.01〕，可能对长寿不利。Schachter等报道法国百岁老人的ApoE基因型频率中，ε2为12.8％明显高于年轻对照组的6.8％，而ε4为5.8％，较对照组的11.2％明显低，ε2和ε4在2组之间相差几乎为2倍。由此以为法国老人长寿与ApoE基因多态性相关，ε2具有延长效应，ε4则有缩短效应。但是在本组研究中，ε2，ε4等位基因未表现出有差异。另有相关研究表示清楚，ε4等位基因具有明显的升高血清总胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白B的作用，而血脂代谢异常在冠心病发病中起重要作用。本研究中，3组间生化及体重指数、血压等的比拟中，体质指数、收缩压、舒张压表现出有差异，但均在正常范围之内，故在本研究中未进一步研究。3组间低密度脂蛋白比拟也有差异，长寿组血中低密度脂蛋白含量较老年组和对照组低，血中低密度脂蛋白含量高可引起血管中脂质沉积增加、动脉粥样硬化，是心脑血管疾病发生的基础，因