无乳链球菌口服疫苗免疫罗非鱼的免疫机制与效果研究,渔业论文

无乳链球菌口服疫苗免疫罗非鱼的免疫机制与效果研究,渔业论文无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)又称B群链球菌(groupBstreptococci,GBS),在自然界,也是一种重要的水产动物致病菌。鱼类无乳链球菌病的流行与爆发在很多国家均有报道,给罗非鱼养殖业带来严重的经济损失。近年来,鱼类无乳链球菌病在我们国家的发生率呈上升趋势,十分是位于我们国家南部的广东、广西和海南等地爆发严重。当前,对于罗非鱼链球菌病的防治方式方法多样,华而不实使用疫苗免疫是最重要的方式方法之一。因而,我们国家正大力发展罗非鱼无乳链球菌病疫苗的研究,并获得一定进展。本试验利用自行研制的无乳链球菌口服疫苗免疫罗非鱼,应用HE染色方式方法观察肠绒毛形态构造、杯状细胞以及上皮内淋巴细胞的分布和数量,讨论该疫苗的免疫机制及不同免疫剂量的免疫效果,以期为该疫苗的深切进入研究和推广应用积累资料。1、材料与方式方法1.1材料试验用罗非鱼由广西水产研究所国家级罗非鱼良种场提供,体重为100g10g,体长为15cm2cm;无乳链球菌GX035弱毒苗由广西水产研究所鱼类病害防治实验室提供。1.2方式方法1.2.1饲养管理罗非鱼饲养于室内水箱中(规格:70cm50cm40cm),各组水质均为脱氯自来水,全天供氧。试验期间水温保持在27℃~29℃,每周换水2/3。天天饲喂2次(8:00和16:00),日投饲率为2%~3%。1.2.2试验分组与处理选用体重为100g10g,体长为15cm2cm的健康罗非鱼共125尾,随机分为5个试验组,每组25尾鱼。免疫前驯养2周。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为免疫组,分别投喂剂量为1.0106、1.0107、1.0108、1.0109CFU/mL的口服型无乳链球菌GX035弱毒苗(每100g饲料用100mL相应浓度的菌悬液拌匀后在50℃烘箱中烘干),试验Ⅴ组为空白对照组,投喂未添加疫苗的饲料,根据2.5g/尾进行投喂。1.2.3组织切片制备免疫接种15d后,从各组中随机抽取1尾(共5尾)罗非鱼进行解剖,迅速取出前肠、中肠和后肠分别制样。前肠在胃后端至肠道的第一个弯曲之间取材,中肠在肠道的第一个弯曲至最后一个弯曲之间取材,后肠在肠道最后一个弯曲至肛门之间取材,各肠段长度约1cm。将肠段浸入pH7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中冲洗肠道内容物,使用Bouin固定液固定各肠段后,制作石蜡切片,HE染色,显微镜观察。1.2.4各指标的形态观察和测量参照黄玉章等提供的方式方法,每段肠道选取5张染色效果较好的切片于400倍镜下对下面指标进行观察:肠绒毛、各肠段肌层厚度、杯状细胞、上皮内淋巴细胞,并应用图像分析系统(Superimageverson6.0.1.2)对其进行拍照和测量。1.2.5攻毒试验免疫20d后,所有鱼(各组均为20尾)均根据1.67107CFU/尾的剂量腹腔注射感染无乳链球菌,记录攻毒后10d内各组鱼的死亡数,并计算相对免疫保卫率(RPS)。1.2.6数据处理应用SPSS19.0统计软件的单因素方差分析进行生物学统计。结果用平均值标准差表示。P0.05为差异显著,P0.01为差异极显著,P0.05为差异不显著。2、结果2.1罗非鱼肠绒毛长度的变化各试验组不同肠段的肠绒毛长度均呈现前肠最长,中肠次之,后肠最短的规律。免疫组与对照组不同肠段肠绒毛长度相比,差异均不显著(P0.05)(表1)。2.2罗非鱼肠道肌层厚度的变化各试验组不同肠段的肌层厚度均呈现前肠最薄,中肠次之,后肠最厚的规律。免疫组与对照组相比拟,前肠肌层厚度:免疫Ⅰ组与对照组相比有增厚,但差异不显著(P0.05),免疫Ⅱ组~Ⅳ组较对照组增加20.96%、20.09%、31.51%,差异极显著(P0.01);中肠肌层厚度:免疫Ⅰ组与对照组相比有缩短,但差异不显著(P0.05),免疫Ⅱ组~Ⅳ组较对照组均有增加趋势,华而不实免疫Ⅳ组较对照组增加17.01%,差异极显著(P0.01);后肠肌层厚度:各免疫组较对照组均增厚,华而不实免疫Ⅱ组增加10.95%,差异显著(P0.05),免疫Ⅳ组增加19.41%,差异极显著(P0.01)(表2)。2.3罗非鱼肠道黏膜的形态构造观察肠黏膜层具有环形皱襞、肠绒毛和小肠腺,黏膜上皮由柱状细胞、杯状细胞和内分泌细胞等组成。400倍镜下观察,各组肠段肠黏膜都较完好,层次分明。肠绒毛排列整洁,肠黏膜上皮细胞形状规则,排列严密,染色鲜明。各免疫组肠绒毛顶端稍有脱落,固有层中轴稍有增宽(图1)。2.4对杯状细胞分布及数量的影响罗非鱼肠道组织经HE染色后,显微镜下观察杯状细胞呈蓝色或空泡状。各肠段上皮均有杯状细胞分布,散在分布于柱状细胞之间,其顶部胞质因大量糖原颗粒拥塞而膨胀,底部纤细,呈高脚杯状。HE染色后,其顶部多糖成分因水解而呈现空泡状(图1)。免疫后各免疫组肠道内,呈蓝色的杯状细胞数量均比对照组有所减少,差异极显著(P0.01)(表3)。2.5对上皮内淋巴细胞分布及数量的影响对照组肠道上皮内淋巴细胞多数位于上皮细胞基膜附近,少量见于上皮游离面,各免疫组肠道上皮淋巴细胞的分布则有所不同,上皮游离面的淋巴细胞增加,而且在固有层的分布亦增加,出现聚集现象(图1)。各免疫组前肠上皮内淋巴细胞数量与对照组相比拟,差异均不显著(P0.05);免疫各组中肠上皮内淋巴细胞数量与对照组相比拟均显著增加,华而不实免疫Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组分别比对照组增加31.97%、31.51%、42.43%,差异极显著(P0.01),免疫Ⅲ组增加19.66%,差异显著(P0.05);免疫各组后肠上皮内淋巴细胞数量与对照组相比拟也均显著增加,华而不实免疫Ⅰ组(1.0106CFU/mL)、免疫Ⅱ组(1.0107CFU/mL)和免疫Ⅳ组(1.0109CFU/mL)分别比对照组增加34.82%、33.21%、38.32%,差异极显著(P0.01),免疫Ⅲ组(1.0108CFU/mL)比对照组增加27.09%,差异显著(P0.05)(表4)。2.6攻毒后的保卫效果试验Ⅰ~Ⅳ组的相对保卫率分别为16.67%、27.78%、55.56%和66.67%,Ⅳ组相对保卫率最高(表5)3、讨论肠上皮内淋巴细胞是一群特殊的淋巴细胞,主要见于肠绒毛上皮细胞间,是机体免疫系统中与外来抗原以及微生物最先接触的免疫细胞,介入肠道黏膜免疫反响,处于免疫防御的第一线。肠黏膜上皮与肠腔大量微生物、食物抗原接触后,可通过调节肠上皮内淋巴细胞以预防肠腔致病微生物侵袭和对无害抗原产生耐受。因而,肠上皮内淋巴细胞数量的变化在一定程度上反映肠道局部黏膜免疫反响状况。黄春兰等研究表示清楚,口服免疫ISCOMs疫苗一定时间后能够刺激肠上皮内淋巴细胞增殖,且不同肠段的变化规律不同;前、中肠变化趋势类似,均表现为先下降后上升,华而不实免疫后14d肠上皮内淋巴细胞与对照组相比总体呈下降趋势,21d后数量开场上升,而后肠上皮淋巴细胞在免疫后7d小幅上升后持续降低,21d后到达试验期间最低值。研究结果表示清楚,免疫后15d,中、后肠上皮内淋巴细胞与对照组相比总体呈上升趋势,且免疫Ⅳ组1.0109CFU/mL效果最明显;而前肠上皮内淋巴细胞数量与对照组相比差异均不显著。表示清楚口服疫苗后,疫苗直接进入肠道,可激活上皮内淋巴细胞。不同肠道上皮内淋巴细胞数量变化规律不同,不同浓度的疫苗免疫后产生的效果不同,免疫后15d,免疫Ⅳ组1.0109CFU/mL上皮内淋巴细胞数量增殖最多,效果最明显。不同肠道上皮内淋巴细胞数量变化呈现不同规律,分析原因可能是前、中、后肠的生理构造不同,进而免疫功能有所区别,但不同肠道上皮内淋巴细胞数量变化的详细规律以及对鱼体免疫功能的影响还需进一步深切进入研究析。黏液细胞是黏液分泌的生理基础,它是鱼类上皮中的一种腺体细胞,广泛分布在皮肤、鳃、消化道等部位。这类细胞分泌的黏液除了具有机械性屏障、化学屏障,调节浸透压、润滑等作用外,黏液中含有的黏多糖、糖蛋白、免疫球蛋白及各种水解性酶类等非特异性的免疫活性物质,可抵抗病原微生物入侵,进而保卫鱼体不受细菌、病毒等的损害。杯状细胞是典型的黏液细胞,主要分布于消化道和呼吸道黏膜的上皮内。正常情况下,底部狭窄构成长柄状附着于基膜上,顶部充满分泌颗粒而膨大,呈高脚杯状,经HE染色后为蓝色或空泡状。杯状细胞是肠道黏膜免疫应答的重要成员,其数量及形态的变化在一定程度上反映肠道的局部免疫状况。本试验结果表示清楚,各免疫组肠道内,呈蓝色的杯状细胞数量均比对照组有所减少,差异极显著(P0.01),但呈空泡状的杯状细胞明显增加,且主要分布于肠绒毛底部或上部。表示清楚经口服免疫后,杯状细胞呈现活泼踊跃的分泌状态,无乳链球菌弱毒苗在一定程度上能加强肠道杯状细胞的合成分泌功能。除此之外,良好的肠道黏膜形态构造对保持鱼类的健康及维持正常生产性能具有重要意义。研究结果表示清楚,各免疫组肠黏膜都较完好,但均发现肠绒毛顶端稍有脱落,固有层中轴稍有增宽的现象,表示清楚弱毒苗免疫后,罗非鱼相关免疫反响被激活,肠道会发生稍微的炎症反响,出现肠道组织构造稍微损伤等现象。赖翔等研究证明,饲粮添加苏氨酸能在一定程度上减缓PRV弱毒苗诱导的免疫应激带来的断奶仔猪生长性能下降和肠道损伤;一些研究证明,黄芪多糖、低聚木糖、木聚糖酶等饲料添加剂可促进鱼的生长发育,促进受损肠黏膜细胞的修复;因而在使用无乳链球菌弱毒苗免疫时,可在饲养经过中适当配合使用饲料添加剂,以改善弱毒苗的不良影响。组织学观察表示清楚,无乳链球菌口服弱毒疫苗可刺激肠道上皮内淋巴细胞活化增殖,促进肠道杯状细胞的合成及分泌功能等,华而不实以免疫Ⅳ组1.0109CFU/mL变化最为明显;同时攻毒感染试验结果显示,免疫组的罗非鱼因不同免疫