临床输血学检验(技术)：3红细胞血型检测技术

第二章红细胞血型检测技术P36血型血清学检验的重要性血型血清学检验是输血前检查的必要内容，是输血安全的重要保证，同时也是新生儿溶血病、器官移植等重要的实验室检查。红细胞抗原抗体反应基本理论红细胞抗原与相应抗体无论是在体内或是在体外，均可发生反应。体外试验红细胞抗原抗体反应的本质是凝集反应，其中抗体以前多从人血清中提取（但现在的抗A、抗B试剂一般为基因工程制备的单克隆抗体），又称为血清学试验。1．反应类型在试管中，红细胞血型抗原抗体反应主要表现为凝集反应、溶血反应、沉淀反应等形式，其中溶血反应必须有补体参与，Ca２＋和Mg２＋参与补体激活。因此，在红细胞抗原抗体反应中，溶血反应也是阳性结果。2．反应特点（1）特异性（2）可逆性（3）比例性（4）阶段性3．影响凝集反应的因素（1）pH：接近生理性pH范围。（2）离子强度：低离子强度溶液（LISS）减少了红细胞周围的阳离子云，从而促进了带正电荷的抗体与带负电荷的红细胞发生反应。LISS增加抗体筛查和交叉配血试验的敏感性，现已广泛应用到临床上。（3）温度：一般IgM抗体适宜温度为4～25℃，称为冷抗体，IgG抗体在37℃时活性较好，称为温抗体。一般在室温和37℃检测抗体活性。（4）孵育时间：一般盐水介质中，37℃孵育30分钟可以检出多数具有临床意义的IgG抗体。第一节红细胞血型系统检测技术1.盐水介质试验技术2.抗球蛋白试验技术3.微柱凝胶介质试验技术4.聚凝胺介质试验技术5.酶介质试验技术6.吸收放散试验7.凝集抑制试验一、盐水介质试验技术P411．原理在盐水介质中，红细胞抗原和IgM抗体反应，出现肉眼可见的凝集现象，属于直接凝集反应。2．方法及应用根据载体不同，主要有试管法、平板法和微孔板法。①试管法为定性或半定量试验方法，可用于ABO和Rh血型定型、不规则抗体筛查和鉴定、交叉配血及抗体效价测定等；②平板法和微孔板法为定性试验方法，加样与观察结果同试管法，用于ABO血型和RhD抗原鉴定。二、ABO血型鉴定盐水介质试验ABO血型鉴定包括正定型和反定型。1.正定型（forwardtyping）：是指用已知特异性抗体鉴定红细胞的抗原；2.反定型（reversetyping）：是指用已知血型红细胞鉴定血清中的抗体。正、反定型结果应相互验证，结果一致才能报告ABO血型结果。ABO血型正反定型结果判定表抗体+受检者红细胞（正定型）受检者血型受检者血清（血浆）+标准红细胞（反定型）抗A抗BAcBcOc+-？-+--+？+----？++-++？---报告结果：红细胞ABO血型鉴定：

型（盐水介质试管法）。注意事项1.玻片法：可否用于反定型？2.试管法和微孔板法鉴定ABO血型时必须做正、反定型，两者结果一致才能报告结果。3.反定型意义在于：①能够复检正定型血型结果的准确性，纠正漏检、误报；②发现正定型难以发现的弱抗原亚型，如A2B型，在正定型中因其A抗原较弱而常常被误定为B型；③能够纠正某些患者因疾病原因造成的红细胞抗原减弱所致血型错误；④能够排除获得性抗原（如类B抗原）和冷凝集现象对红细胞定型的干扰；⑤发现一些亚型中的不规则抗体。4.加样顺序：一般应先加抗体（血浆或血清），后加红细胞悬液，以便核实是否漏加抗体（血浆或血清）5.离心离心能促进抗原和抗体的接触和结合，提高反应敏感性和缩短反应时间，但离心时间和速度应严格遵从操作规程，防假阳性或假阴性结果。6.温度：

IgM抗A和抗B与相应红细胞反应的最适温度为4℃，但为了防止冷凝集的干扰，一般在室温（20～24℃）下进行试验，37℃可使反应减弱。

7.结果观察顺序：溶血和凝集都是阳性结果，先看溶血，再看凝集。ABO血型鉴定正反定型结果不一致1．导致正反定型结果不一致的原因（1）技术失误和人为原因1）器材不洁净、试剂失效或污染、标准抗血清效价和亲合力达不到要求：如抗A效价不高，可将A亚型误定为O型，AB型误定为B型等。2）标本张冠李戴，漏加或错加试剂和标本、细胞与血清反应比例不适当（红细胞悬液过浓或过淡，体积比例不当）、离心过度或不足、未注意观察溶血现象、结果判断、记录或书写错误等。（2）受检者红细胞的原因1）红细胞抗原性减弱：新生儿或老年人；受检者红细胞上抗原位点过少（如A2、A2B等亚型）；白血病或恶性肿瘤等。2）多凝集红细胞：红细胞膜发生异常，红细胞与其他所有人的血清，甚至包括自身血清都出现凝集。3）嵌合体血型：体内有两组红细胞群体，定型时可以出现“混合外观凝集”，可见于异卵双胎。混合外观凝集（MF）：P384）红细胞致敏：受IgG不完全抗体致敏的红细胞，在含高蛋白介质的试剂中，可发生凝集。5）异形红细胞：微柱凝胶血型卡法检测时，镰形红细胞可致假阳性结果。（3）受检者血清的原因

1）抗体减弱或缺乏：新生儿和出生６个月之内的婴儿血液中无ABO抗体或抗体很弱；老年人血清中ABO抗体水平下降，反定型时可出现不凝集或弱凝集；丙种球蛋白缺乏症患者血清中缺乏应有的抗A、抗B。2）获得性抗体：新生儿血清中可能存在来自母体的抗体；使用大量的非同型的血浆做置换治疗，标本血清中含有供血者的抗A、抗B。3）异常血浆蛋白：肝病、多发性骨髓瘤患者血清中球蛋白增多，心肌梗死、感染及外伤等引起患者血清中纤维蛋白原增多，这些常引起红细胞呈缗钱（串）状排列，造成假凝集。4）血型特异性物质过高：一些卵巢囊肿病例，血液中血型物质浓度很高，可中和抗A、抗B，要多次洗涤待检红细胞。5）自身抗体：自身免疫性贫血患者血清中存在温性自身抗体，能凝集自身和其他血型红细胞。6）不规则抗体：受检者血浆中含有ABO血型抗体以外的不规则抗体，与标准红细胞上其他血型抗原系统的抗原起反应。7）药物：药物如低分子右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮及静脉注射某些造影剂，血液粘滞性增高，可使红细胞凝集而类似凝集表现。2．正反定型结果不符合分析程序及解决方法：首先应重复试验1次，严格执行操作规程，使用质量合格的试剂及仔细观察凝集结果；如重复试验仍然结果不符，则进一步进行以下试验：（1）重新采集受检者的新鲜血液标本，避免标本采集错误或原标本受污染所导致的错误结果。（2）查询受血者既往病史、输血史和用药史等。（3）将受检者红细胞洗涤数次，应换用新开启的确定为无细菌污染的生理盐水洗涤红细胞，用抗AB、抗A1或抗H检测红细胞。（4）对受检者红细胞直接作抗球蛋白试验，如阳性，表示红细胞已被致敏。（5）用A1、A2、B、O型红细胞及自身红细胞检查受检者血清。（6）如怀疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗A或抗B血清作吸收及放散试验，以及受检者唾液作A、B及H物质测定。（7）分析O型筛选细胞检测结果，确定是否是同种异型或自身冷抗体干扰正反定型结果。临床应用1．用于输血前的检查：输血前必须准确鉴定供血者与受血者的血型，选择同型血源，经交叉配血相符后才能输血。2．用于器官移植前的检查：ABO血型抗原广泛地分布于人体内除中枢神经细胞外的各种组织细胞、体液、分泌液中，是一种移植抗原。在器官移植时，应力求受体和供体的ABO血型一致。3．用于新生儿溶血病的检查：母子ABO血型不合可引起新生儿溶血病，主要通过血型血清学检查来诊断。几种血型鉴定方法学的比较（1）玻片法：不需要离心，操作简单，可用于大规模普查，但费时，灵敏度差；不适于临床常规使用及不适于反定型；容易污染环境和工作人员。（2）试管法：①常规血型鉴定方法，敏感，结果可靠，可发现亚型或较弱抗原抗体反应；②所需时间短，适用于急诊血型鉴定；③应用广泛：可用于定性试验，也可用于半定量试验，如抗体效价测定。临床上主要用于血型鉴定、血清中IgM抗体的筛查和鉴定、交叉配血等。但与玻片法相比较，操作相对复杂。（3）微孔板法：可自动化、标准化，适于大量标本血型鉴定，中心血站应用较多。但需要特殊仪器设备。二、抗球蛋白介质试验技术P43抗球蛋白试验是1945年由R.R.A.Coombs等建立的，又称为Coombs试验。抗球蛋白试验是经典的血清学实验技术，主要用于检查IgG等不完全抗体参与的抗原抗体反应，也可测定补体组分C3、C4片段参与的免疫反应。1.抗球蛋白试验原理在合适的温度及一定的反应时间等条件下，IgG血型抗体能与红细胞膜上相应抗原结合而使红细胞致敏，但多数IgG抗体不能在盐水介质中使致敏的红细胞出现肉眼可见的直接凝集。当加入抗球蛋白试剂后，该抗体（二抗）的Fab片段可与包被在红细胞膜上的IgG血型抗体（一抗）的Fc片段结合发生抗原抗体反应，通过抗球蛋白抗体的“搭桥”作用，促使原来已致敏的红细胞发生肉眼可见的凝集反应。因此采用此种方法能够检测出血清中是否存在不完全抗体。2.抗球蛋白试验分类及应用根据试验目的不同，分为:直接抗球蛋白试验（directantiglobulintest，DAT）间接抗球蛋白试验（indirectantiglobulintest，IAT）（1）直接抗球蛋白试验（DAT）：抗球蛋白试剂直接与红细胞反应，如出现肉眼可见的凝集，称为直接抗球蛋白阳性。直接抗球蛋白试验主要用于新生儿溶血病的诊断、溶血性输血反应的调查、自身免疫性溶血性疾病和药物免疫性溶血性疾病的诊断等。直接抗球蛋白试验用于检测体内不完全抗体致敏的红细胞。（2）间接抗球蛋白试验（IAT）：红细胞在体外与不完全抗体结合后，再加入抗球蛋白试剂进行检测的试验称为间接抗球蛋白试验。主要用于血清中不完全抗体筛查和鉴定、交叉配血试验、检测红细胞上的血型抗原（如Rh、Duffy，Kell，Kidd等血型系统）、白细胞和血小板抗体试验等。间接抗球蛋白试验用于证实体外致敏的红细胞。4.抗球蛋白试验的技术特点（1）抗球蛋白试验是最可靠的确定不完全抗体的方法，具有特异性强、灵敏度高的特点，已成为临床上保障安全输血、诊断和预防新生儿溶血病、自身免疫性溶血性疾病等研究工作中最主要的实验技术。（2）经典的试管法抗球蛋白试验虽较灵敏，但其操作繁琐，反应时间较长，不适用于急诊检查和大批量样本的检测，始终未能在临床常规应用。洗涤非常重要！三洗三、微柱凝胶介质试验技术P521．微柱凝胶试验（microcolumngelassay）：1986年建立，红细胞抗原抗体在微柱腔内的凝胶介质中发生肉眼可见的凝集反应。2.原理：葡聚糖凝胶颗粒-凝胶微柱-微柱凝胶卡。是利用凝胶颗粒之间的间隙形成的分子筛作用，在微柱凝胶介质中红细胞与相应抗体结合，经低速离心，凝集成块的红细胞因体积大被凝胶阻滞不能通过凝胶层，留于凝胶介质的上层或中间，即阳性反应；未凝集游离红细胞因体积小而通过凝胶之间的间隙沉积于微柱凝胶检测管底部，形成细胞扣，即阴性反应。

微柱凝胶试剂卡分类应用中性凝胶试剂卡：用于ABO血型正反定型、RhD抗原测定、其他血型抗原鉴定及盐水介质交叉配血等；特异性凝胶试剂卡：用于ABO血型正定型、RhD抗原测定和其他血型鉴定；抗球蛋白凝胶试剂卡：用于IgG抗D抗体鉴定RhD抗原，红细胞不规则抗体筛查和交叉配血等。卡式法的优点：1）结果敏感、准确：灵敏度、准确度比传统的玻片法和试管法液体介质中的凝集试验更高，重复性好，肉眼观察清晰明确，易于判定且客观，避免了因经验不足对结果判断的影响。2）结果保存时间长：在室温条件下，凝胶试剂卡一般可保存数天甚至数周，也可以拍照保留试验结果图像存档备用。3）标本用量少：标本用量为试管法的1/10～1/5，尤其有利于新生儿及某些特殊血液标本的检测。4）操作简便：不需要洗涤，对阴性结果不需要确证试验，适于大量标本检测。可单份标本多项指标一次离心检测，简化了操作程序。5）自动化和标准化：配套仪器可以自动配制RBC悬液、自动加样、自动判定实验结果，易于自动化和标准化。6）检验项目齐全、应用范围广：可用于ABO血型正反定型、其他血型定型、交叉配血、抗体筛查、抗体鉴定等。7）安全：减少了接触血液标本及病原微生物的机会，减少了医源性感染。卡式法的缺点：本法试剂卡较贵，需要特殊离心机，其配套设备价格昂贵，不适合标本量较少的单位开展工作。Q：什么是微柱凝胶卡实验结果的双群现象？如何对双群现象的结果进行判读？微柱凝胶抗球蛋白试验在含有抗球蛋白的凝胶介质中进行的抗球蛋白试验称之为微柱凝胶抗球蛋白试验.即微柱凝胶Coombs试验（MG-Coombs’Test）。MG-Coombs’T孵育后的红细胞不需三洗，且孵育时间只需15分钟，显著提高了免疫凝集试验的敏感性，使其能更广泛地应用在临床输血检验中。四、低离子聚凝胺介质试验技术P461980年建立聚凝胺（polybrene，Poly）是一种由4个胺聚合而成的高价阳离子聚合体，在液体中可产生多个阳离子基团，能够中和红细胞表面唾液酸所带的负电荷，从而缩短红细胞间的正常距离。1.原理A.利用低离子强度溶液（LISSorLIM）降低溶液的离子强度，减少红细胞周围的电子云，促使血型抗体与红细胞膜上相应抗原结合。

B.加入聚凝胺(Polybrene)溶液，带正电荷的聚凝胺大分子聚合物能够中和红细胞表面的负电荷，减弱红细胞间的静电斥力，缩短红细胞间的正常距离.

在离心力作用下，可使正常红细胞形成可逆性的非特异性聚集。C.加入枸橼酸钠重悬液，枸橼酸根的负电荷能中和聚凝胺的正电荷.由抗体介导的特异性凝集则不会消失，出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。由聚凝胺引起的非特异性聚集会因电荷中和而消失，为阴性反应。2.低离子聚凝胺试验技术特点

该方法能检出完全抗体和多数不完全抗体，具有简便、快捷、成本较低等优点。尽管此法的灵敏度较盐水介质试验有了提高，但其根本还是一种非特异性促凝手段，仍不能使灵敏度达到最理想的临床应用水平。该方法操作难以标准化、影响因素多、缺乏完善的质控体系，易造成假阴性结果，易漏检低效价抗体。3.低离子聚凝胺试验技术应用在抗体筛查、交叉配血和血型鉴定中具有一定应用价值，但对Kell血型系统的抗体检测不理想。临床应用

主要用于急诊抢救患者的交叉配血试验。如果用聚凝胺介质交叉配血出现不配合时，要用抗球蛋白试验重复。结果不一致时，以抗球蛋白结果为准。五、酶介质试验技术P42红细胞膜表面唾液酸所带负电荷，能够使红细胞相互排斥，保持悬浮状态。因IgG抗体分子的跨度小于正常情况下红细胞间的距离，IgG抗体与红细胞抗原结合后，不足以把红细胞拉在一起而引起肉眼可见的凝集。某些蛋白水解酶，可以破坏红细胞表面的唾液酸结构，从而减少了负电荷的数量，缩短红细胞间的距离，促进某些抗原抗体反应。酶技术对Rh、Kidd血型系统的检出效果最好，但对MNS和Duffy血型系统抗原的破坏较为显著。目前临床常用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶。酶试验技术的应用：1.鉴定RhD抗原鉴定2.交叉配血试验等Rh血型鉴定方法盐水介质（玻片法、试管法）----IgM抗D试剂酶介质法----IgG抗D试剂抗人球蛋白介质法----IgG抗D试剂低离子强度聚凝胺法微柱凝胶法六、吸收放散试验P48抗体与相应抗原在适合条件下可发生凝集或致敏，但这种结合是可逆的，如改变某些物理或化学条件，抗体可以从结合的红细胞上解离下来。红细胞与血清混合，在一定条件下，红细胞表面某种抗原可特异性地与血清中相对应的抗体结合，使血清中该抗体的效价显著降低或消失，称为吸收试验（absorptiontest）。根据待检标本中所含抗体的最适反应温度，对其进行吸收。冷抗体4℃反应最强，常用冷吸收试验.温抗体吸收采用酶处理后的红细胞37℃孵育。放散试验是把结合到红细胞上的抗体解离下来，用于其他目的。ABO抗体首选热放散方法（56℃）Rh抗体首选乙醚放散方法。吸收放散试验的临床应用1．去除血清中不需要的抗体：当存在冷抗体、自身抗体或抗血清试剂中混有其他特异性抗体时，可利用吸收试验去除这些不必要或干扰试验的抗体。2．证实存在于红细胞上的弱抗原：如在ABO亚型鉴定中，红细胞上的ABH抗原有时很弱，可能与相应试剂血清反应后不出现明显凝集反应。经过吸收放散后，测定放散液中的抗体，可以确定红细胞上带有的抗原。3．分离、鉴定混合抗体：当血清中存在多种血型抗体，并要求鉴定抗体特异性时，可以利用吸收放散试验将抗体分离开来，并分别加以鉴定。4．浓缩低效价抗体：当血清抗体效价很低，可以利用吸收放散试验浓缩抗体。如利用红细胞膜做吸收放散试验可以浓缩低效价的抗血清，使之成为可利用的试剂。5．鉴定抗体特异性：用已知抗原红细胞吸收抗体，有助于鉴定、核实该抗体特异性。6．利用吸收放散技术鉴定引起新生儿溶血病和免疫性输血反应的抗体。7．研究鉴别免疫性溶血性贫血的抗体。七、凝集抑制试验P50血型抗原除了存在于人体红细胞膜上外，某些血型抗原也以游离的形式存在于血浆、体液和分泌物中，称为可溶性血型物质。这些血型物质可与相应的血型抗体结合而中和该抗体，从而使该抗体凝集对应红细胞的能力受到抑制，此种试验称为凝集抑制试验。唾液中ABH血型物质能特异地与相应抗体结合，从而抑制抗体再与相应红细胞抗原发生凝集反应，由此可以判断受检唾液中是否有血型物质存在及其类型。临床应用：1．辅助ABO血型亚型分类及特殊情况下进行血型鉴定。2．证明可溶性血型物质的存在。3．用于司法鉴定及考古鉴定。第二节输血相容性检测

输血前三项试验：红细胞ABO血型和RhD血型鉴定（血型）交叉配血试验（配血）不规则抗体检测（抗筛）输血前三项试验是安全输血的保障理论基础：免疫血液学临床安全有效输血的免疫血液学底线是：病人与供者红细胞：1.血型“相同”（same,identification）：病人与供者血型完全一样。2.或者血型“相容”(compatibility,matching)：供者红细胞能被病人容纳，不被破坏。输血前血型相容性试验3.“相容”的本质是：病人没有针对供者红细胞的抗体。4.判断“相容”的标准是：配血无凝集5.坚持“配不上血，决不输血”的原则输血前三项试验，哪项最重要：配血第一：是“安全输血生命线”血型第二抗筛第三只要配血不相容：即便是：1.病人与供者血型“相同”2.病人抗筛阴性一定会发生溶血性输血反应或者无效输血！必须配血无凝集才能输血！一、交叉配血试验P40将供血者的红细胞、血浆分别与受血者的血浆、红细胞混合，观察有无溶血或凝集，称为交叉配血试验。主侧和次侧交叉配血主侧交叉配血试验：用受血者血浆与供血者红细胞进行反应，检查受血者血浆中是否存在针对供者红细胞的抗体；次侧交叉配血试验：用受血者红细胞与供血者血浆进行反应，检查供血者血浆中是否存在针对受血者红细胞的抗体。自身对照：患者红细胞与自身血清，以排除自身抗体。目前，临床上交叉配血试验主要用于红细胞和浓缩血小板输注前的相容性检查。我国《临床输血技术规范》未要求血浆和单采血小板输注前需要做交叉配血试验。

交叉配血试验根据所使用的介质不同分为：盐水介质法低离子聚凝胺介质法抗球蛋白介质法微柱凝胶抗球蛋白法酶介质法交叉配血反应体系均应有37℃孵育这个步骤。盐水介质交叉配血试验是临床输血前最基本的相容性试验，简便快速。但只能检出不相配合的IgM完全抗体，不能对IgG不完全抗体进行检测。盐水介质交叉配血试验应与检测不完全抗体的配血方法（如抗球蛋白试验）联合检测，以防止漏检不完全性抗体，以确保输血安全。二、不规则抗体筛查P39目的：在输血前检查患者血液中是否存在有临床意义的意外抗体。所谓有临床意义的不规则抗体一般指能够引起溶血性输血反应、新生儿溶血病；或者使输入的红细胞存活时间缩短且在37℃下有反应的同种异型抗体。除了ABO血型系统抗A和抗B外，其他血型系统抗体的产生没有规律，不符合Landsteiner规则，称之为不规则抗体或意外抗体。抗A1抗体，也属于不规则抗体。抗体筛查通常在配血前进行。凡遇有下列情况必须进行不规则抗体筛查试验：①交叉配血不合时；②有输血史、妊娠史；③短期内需要