细胞生物学基本实验技术

细胞生物学基本实验技术

细胞水平亚细胞水平

分子水平

显微技术细胞分离技术细胞培养技术细胞组分的分级分离细胞内分子示踪细胞分子生物学技术一、显微镜技术microscopy

μm

微米

=10-6m

nm

纳米

=10-9m

Å

埃

=10-10m

(一)光学显微镜技术

利用光线照明,将微小物体形成放大影像的仪器

1.显微镜的分辨率显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。

d=

光学显微镜的分辨极限0.2μm0.61λ

nsinθ

100μm0.2μm2.光镜标本切片的制备

(1)

固定

定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细胞中大分子间形成交联，保持细胞中原有结构的形态和位置的过程。

固定的目的：

A防止组织自溶或腐败

B保持细胞原有的形态

C保持细胞各种成分的原有位置

常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛

(2)脱水

定义：借助某些化学溶剂置换组织内水分的过程。

常用的脱水剂：酒精

(3)包埋

定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。

常用的包埋剂：液体石蜡、树脂

(4)切片

1-10μm

（5）染色采用某些化学物质特异性或选择性地与细胞内的某些成分相互作用，从而原位显示细胞某种成分或结构的方法

A选择性染色

考马斯亮蓝染色细胞中蛋白质Brachet反应染色RNA,DNA

苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色病理组织切片最常用的方法苏木素：碱性染料结合DNA

细胞核染成蓝色伊红：与细胞浆中成分不同程度结合

将其染成不同程度红色B特异性染色

酶+底物

抗原+抗体+substrateantigenantibody************酶标记：免疫组织化学技术荧光标记：免疫荧光技术3.荧光显微镜技术

(1)原理荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光

可见光紫外光红外光shortlongλ

（2）荧光显微镜的基本构造

A紫外光光源

B二向色镜：反射短波光线，透过长波光线

C滤光片

（3）常用的荧光染料

A有机染料荧光素罗丹明

FITCB量子点quantumdotⅡ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素构成的半导体纳米结晶良好的光学稳定性抗光漂白性（4）应用

A免疫荧光显微技术（Immunofluorescencemicroscopy）采用荧光素标记的已知抗体作为探针，检测待测组织、细胞中靶抗原，以达到对抗原物质进行定位、定性和定量的目的。

B绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein,GFP)发现于水母中,在蓝色波长范围内的光线激发下，能够产生绿色荧光，其基因常被用作报告基因。

4.相差显微镜（phasecontrastmicroscope）

(1)原理

波长颜色振幅

亮度速度

相位

相差显微镜将光线通过标本产生的相位差转变为振幅差人眼可感知(2)应用

活体细胞观察5.激光扫描共焦显微镜（Laser

Scanning

ConfocalMicroscope）

(1)原理

在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。单色激光光源光源后－照明针孔－点光源检测器前－探测针孔分层扫描三维重建照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共扼的

（2）应用

细胞的形态定位

细胞的三维重建

细胞定量荧光检测

DNARNA蛋白质含量

活细胞内Ca2+pH动态检测果蝇胚胎原肠胚（二）电子显微镜技术

利用电子与固体样品作用时所发出的信息,

对样品进行微区观察和分析的技术亚显微结构超微结构

1.电子显微镜的特点

高分辨率

理论上

d=0.002nm

实际上

d=0.1nm

生物标本

d=2nm

高放大倍率

1,000,000

阴极阳极聚光镜（电磁透镜）物镜中间镜投影镜电镜照片照相底片真空、上下颠倒

2.透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscope,TEM）

(1)基本构造

透射电镜镜体照明系统成像系统观察记录系统真空系统计算机电路系统(2)透射电镜标本的制备过程样品需特殊制备

高分辨,高放大

保持结构的原有细节—取材、固定

高真空，高电子轰击

耐高真空、高温—

包埋

电子散射能力弱

提高反差—

电子染色

电子穿透能力弱

制作超薄切片—

包埋、切片B固定双固定戊二醛固定蛋白质

锇酸固定膜成分（C=C)A取材

要点：快、冷、小C脱水上升梯度

乙醇：30%50%70%80%90%95%100%

D包埋

使用环氧树脂包埋剂（单体树脂加温聚合）E切片

500–700Å

F

重金属染色

U(醋酸双氧铀)Pb(柠檬酸铅)

NADP酶反应嗜锇反应TPP酶反应2.扫描电子显微镜

（Scanningelectronmicroscopy,SEM）(1)原理

二次电子(2)分辨率

3-10nm(3)样品的制备

A固定

B脱水

C干燥临界点干燥

D染色AuPt透射电镜利用穿透标本的电子进行成像(散射)观察组织的二维切片扫描电镜利用标本表面发射的二次电子成像观察组织的表面三维结构（三）扫描探针显微镜

（Scanningprobemicroscope,SPM）1.扫描隧道显微镜

使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。

分辨率高

可在非真空状态下工作

直接观察大分子的三维结构扫描隧道显微镜下的人红细胞血影2.原子力显微镜

通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息。

样品无需具有导电性

可在三态下工作

活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测原子力显微镜下的中国仓鼠卵巢细胞原子力显微镜观察细胞微丝的动态变化二、细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法

1.制备单一细胞悬液

组织

单一细胞消化EDTA

细胞间连接胰酶

细胞外基质二、细胞分离技术（cellseparation）从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法

1.制备单一细胞悬液

组织

单一细胞消化EDTA

细胞间连接胰酶

细胞外基质2.分离不同类型细胞

(1)

离心（centrifugation）

大小密度形状

小轻不规则

大重圆形(2)免疫磁珠法

利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。

Fe2O3或Fe3O4颗粒

+

单克隆抗体免疫磁珠(3)

流式细胞仪(flowcytometry)

能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或化学特性的技术

A原理:

抗原+抗体*荧光标记

B样品制备

细胞悬液制备细胞固定细胞染色

B应用*细胞分选

cellin10005000cells/sec*细胞大小测量*DNA含量测定*免疫表型分析*细胞功能分析*细胞凋亡研究细胞周期分析

药物处理前后HT29细胞的流式细胞分析结果

G0/G160.86%S29.14%G210.00%G0/G137.68%S37.56%G224.76%AB流式细胞术分析细胞凋亡

ND-1-QD605标记不同大肠癌细胞的流式细胞定量分析(4)激光捕获显微切割技术（Lasercapturemicrodissection，LCM）从组织切片中精确分离获取单一细胞的方法

工作原理及过程:A制备组织切片B镜下将组织切片覆以薄膜C激光束切割特定细胞或区域D收集管收集

三、细胞培养技术（Cellculture）

从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以至增殖的方法

invitro用培养细胞做实验

invivo用动物做实验1.细胞培养的条件

(1)

固体表面：培养瓶、培养皿

(2)培养基常见培养基：1640DMEM

(3)无菌无菌操作：超净工作台、火焰消毒等培养液中加入抗菌素器械、溶液以不同方式进行消毒

（烤箱、高压灭菌、过滤）(4)其他温度37℃

湿度100%CO2浓度5%倒置相差显微镜培养箱2.细胞培养的传代

原代培养:直接取材于有机体的细胞培养取材切割消化培养

传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例扩大培养

原代培养

传代培养(保持分化特性)

传代3.细胞系（Cellline）

在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁殖能力，能够无限传代的细胞群。

变异细胞

细胞系

HeLa人宫颈癌上皮细胞

3T3小鼠成纤维细胞无限繁殖相差显微镜观察培养中的HeLa细胞四、细胞组分的分级分离通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的化学性质和功能进行研究的方法。匀浆分级分离分析

匀浆液膜细胞器大分子

低渗超声去污剂强制过滤研磨

细胞破坏（一）离心法用于分离细胞器和大分子

配平低温

1.差速离心法

分离对象:不同大小和形状的组分

（细胞核、细胞器）

具体方法:由低速到高速逐级沉降(repeat)2.速度沉降法

分离对象:不同大小、形状的组分(沉降系数S)

比差速离心方法更精细

具体方法:

在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质

3.平衡沉降法

分离对象:密度不同的组分（与大小、形状无关）

具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离心介质（20%-70%蔗糖、CsCl）通常采用超速离心

（二）层析法（柱层析）主要用于分离、纯化蛋白质

填充柱填料（固定相）流动相

1.离子交换层析

层析介质:阴离子或阳离子树脂

分离原理:电荷

2.凝胶过滤层析层析介质:凝胶分离原理:分子大小

3.亲和层析

层析介质:

基质+抗体底物

分离原理:

亲和性4.高压液相层析HPLC

基质粒度小（3-10μm）、分辨率高、分离速度快

(三)电泳法

主要用于分离蛋白质、核酸

1.琼脂糖凝胶电泳

分离对象:核酸

支持介质:琼脂糖

凝固点40-45℃

不同浓度凝胶具有不同孔径

电泳缓冲液:TAE\TBE

染料:溴化乙锭EB(三)电泳法

主要用于分离蛋白质、核酸

1.琼脂糖凝胶电泳

分离对象:核酸

支持介质:琼脂糖

凝固点40-45℃

不同浓度凝胶具有不同孔径

电泳缓冲液:TAE\TBE

染料:溴化乙锭EB2.SDS

分离对象:蛋白质(蛋白质分子量、亚单位组成)

样品处理:SDS阴离子表面活性剂

β-巯基乙醇还原剂

大小

电荷

形状

支持介质:

丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺

染色:

考马斯亮蓝银染

特异性蛋白

(westernblotting)SDS3.双向电泳

根据蛋白质分子量、等电点分离

等电聚焦:等电点

SDS:分子量4.Western印迹技术

将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗或生物素标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测.基本步骤:(1)SDS(2)转膜

(3)抗体反应一抗孵育标记二抗孵育

(4)显色westernblotting五、细胞化学和细胞内分子示踪技术

目前普遍应用的细胞内分子示踪技术是基于光镜

和电镜的细胞化学技术细胞化学技术

是一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法，是在保持组织原有结构情况下，利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究其在细胞内的分布、数量及动态变化。包括酶细胞化学技术

免疫细胞化学技术

放射自显影技术等（一）免疫组织化学技术（免疫细胞化学）immunohistochemistry,IHC用标记的特异性抗原或抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应的抗原或抗体进行定性、定位、定量的技术1.脱蜡、水化

二甲苯脱蜡梯度酒精水化2.抗原修复使封闭的抗原暴露

热修复法：微波热修复、煮沸热修复、

高温高压热修复（高压锅）

酶消化法：胰蛋白酶3.灭活内源性过氧化物酶

过氧化物酶阻断剂H2O24.封闭避免非特异性结合

内含BSA的封闭液5.免疫反应

一抗生物素标记二抗6.显色（SP法）

链霉亲和素-过氧化物酶+DAB7.苏木素核复染(二)抗体示踪技术1.抗体+荧光染料

光学显微镜GFP

GFP融合剪切体蛋白2.

抗体+高电子致密物

电子显微镜

胶体金抗体标记胰岛素

(三）放射自显影技术autoradiography

1.原理使用同位素标记

同位素:

核外电子数相同

化学性质相同

原子核重量不同

放射性同位素:衰变

2.应用

条件：同位素可被仪器检测

可被细胞摄入

掺入方法：标记氨基酸示踪蛋白质

标记T示踪DNA

标记U示踪RNA

脉冲标记A放射性物质脉冲掺入活细胞B不同时间取样切片C暗处曝光D显影、定影胰岛素合成分泌过程六、细胞分子生物学技术1.聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）特异性体外DNA扩增技术

利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板，以dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下进行的DNA体外合成技术。

（1）反应体系：模板链

DNA聚合酶

dNTP

引物

（primer）（与模板相应序列互补）

（2）反应步骤：

变性94℃

退火55℃

延伸72℃

2.RealtimePCR

实时定量PCR(荧光定量PCR)通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

荧光信号指数扩增阶段PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系荧光背景信号阶段平台期以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。3.核酸分子杂交

(1)Southernblotting–DNA

将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序列的技术.

(2)Northernblotting

–

RNADNA

DNA

RNADNA

RNA

RNA特异性探针A基因组DNA的消化B琼脂糖凝胶电泳分离C转膜D杂交E放射自显影(3)原位杂交技术（insituhybridization）

用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置的方法。FISH4.基因转移技术应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实现转入基因的扩增或表达。

外源基因细菌转化

真核细胞转染基因