实验四浓度测定及酶切

实验四浓度测定及酶切第一页，共二十九页，2022年，8月28日1、学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液浓度和纯度的原理和方法2、学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度的方法3、学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果，为以后的连接作准备。一、实验目的第二页，共二十九页，2022年，8月28日DNA的吸收光谱峰在260nm处，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50g/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。目前已发现I型、II型和III三类不同的限制性内切酶，其中II型能专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因工程中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平末端。限制性内切酶HindIII识别的碱基序列为：酶切反应需Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高(>5%)，会使酶的识别位点发生改变，产生星活性(staractivity)。绝大多数酶的反应温度37℃，也有个别要求在50~65℃。二、实验原理第三页，共二十九页，2022年，8月28日不同核酸样品在OD260=1时的浓度1、OD260：估算核算浓度2、OD280：估算核算浓度3、OD260：估算核算浓度4、OD260：估算核算浓度OD（opticaldensity，光密度）：表示被测物吸掉的光密度。第四页，共二十九页，2022年，8月28日不同核酸样品在OD260=1时的浓度1、dsDNA=50g/ml(ng/l)2、ssDNA=37g/ml3、RNA=40g/ml4、oligo=30g/mlOD（opticaldensity，光密度）：表示被测物吸掉的光密度。第五页，共二十九页，2022年，8月28日三、实验材料（上次实验提取的质粒pSK和MP3）第六页，共二十九页，2022年，8月28日四、仪器设备五、实验用具Eppendorf分光光度检测仪NanoDrop分光光度检测仪电泳仪

微型电泳槽

BioRad凝胶成像仪

紫外透射检测仪

恒温培养箱

冰盒微量离心管移液器微量离心管（1.5ml1）

吸管头若干

点样板第七页，共二十九页，2022年，8月28日NanoDrop分光光度检测仪第八页，共二十九页，2022年，8月28日NanoDrop测定结果DNA样品纯度好DNA样品纯度差DNA样品纯度差第九页，共二十九页，2022年，8月28日比色皿Eppendorf分光光度检测仪第十页，共二十九页，2022年，8月28日六、试剂琼脂糖5TBE电泳缓冲液

10载样缓冲液（loadingbuffer）

GoldViewI型核酸染色剂（10000）DNA分子量标准（DNAmarker）：MarkerIII已知系列浓度的λDNA（线性DNA分子，长约50kb）(10、20、50、100ng/l)第十一页，共二十九页，2022年，8月28日七、实验步骤（一）分光光度计法测定DNA的浓度和纯度

（二）琼脂糖凝胶电泳法检测DNA浓度（1%agarosegel）

（三）质粒DNA的小量酶切（四）酶切质粒DNA的电泳（1.5%agarosegel）（五）MP3质粒的大量酶切第十二页，共二十九页，2022年，8月28日1、Eppendorf分光光度检测仪：取质粒DNA2l（约100-200ng）至一干净的离心管，加入198l蒸馏水稀释，充分混匀。先加200l蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，然后倒掉蒸馏水，加入200l已稀释的DNA溶液，测定260nm及280nm的光吸收值（OD260及OD280），计算DNA浓度、OD260/OD280（估计核酸纯度）及OD260/OD230（估计去盐程度）比值。（自配溶液提取的质粒DNA）2、NanoDrop分光光度检测仪：先加1l蒸馏水进行紫外光空白测定，然后用滤纸吸掉蒸馏水，加入1lElute溶液，测定上述数值。（制剂盒提取的质粒DNA）（一）分光光度计法测定DNA的浓度和纯度

第十三页，共二十九页，2022年，8月28日1、利用ddH2O将质粒DNA稀释到浓度为10-100ng/l之间，然后分别取稀释的DNA样品和已知浓度的λDNA各1l于点样板小孔中，再加入8lTE和1l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5lMarkerⅢ作为分子量标准。2、打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约半个小时后即可观察。3、将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，对比已知浓度的λDNA条带的粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（二）琼脂糖凝胶电泳法检测DNA浓度（1%agarosegel）

第十四页，共二十九页，2022年，8月28日（三）质粒DNA的小量酶切20l反应体系（1.5ml离心管）：质粒DNA（pSK、MP3）3~5

l（0.5-1g）酶切Buffer

2.0

l

Hind

III酶1.0

l灭菌ddH2O

to

20l加样顺序：水、buffer、DNA、酶37℃恒温箱中放置数小时或者酶切过夜

第十五页，共二十九页，2022年，8月28日1、配制1.5%的琼脂糖凝胶2、酶切的DNA中加入2l的10×loadingbuffer，混匀后取20l上样，同时点未酶切质粒DNA（50-100ng）进行迁移率对比，取5lMarkerⅢ点样作为分子量标准。3、电泳结束后分析酶切后质粒条带的变化、迁移率和不同条带之间的亮度差异；同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（三）酶切质粒DNA的电泳第十六页，共二十九页，2022年，8月28日（四）MP3质粒的大量酶切100l反应体系（1.5ml离心管）：

MP3质粒DNA

2-4

g（试剂盒抽提）酶切Buffer

10

l

Hind

III酶2-4

l灭菌ddH2O

upto

100l加样顺序：水、buffer、DNA、酶37℃恒温箱酶切过夜

第十七页，共二十九页，2022年，8月28日MP3和pSK（+）质粒DNA的HindIII酶切结果第十八页，共二十九页，2022年，8月28日MP3和pSK（+）质粒DNA的HindIII酶切结果第十九页，共二十九页，2022年，8月28日第二十页，共二十九页，2022年，8月28日2，

完成检测后合上滑盖，关闭电源。

第二十一页，共二十九页，2022年，8月28日第二十二页，共二十九页，2022年，8月28日第二十三页，共二十九页，2022年，8月28日分光光度计法测定大肠杆菌液体培养物的OD600值细菌OD的测定原理是细菌颗粒的遮光，可以用来检测细胞数量，而通过数量能反映出细胞生长的状态。菌液浓度太高，用培养基稀释可以降低OD值，但是太高浓度OD值的菌液可能细菌的生长状态不符合要求，比如死的菌体会比较多等。1、在使用分光光度计时，测得的OD值在0

.1-0.4这个区间内最可靠，最好不要超过1.0。因此OD尽量控制在0.1-1之间，最多不要超过2.0。取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。2、空白用不接种的培养基，但是不接种的培养基要和接种的同时培养，以求条件一致。3、OD与体积或者说稀释倍数不一定成正比，如果OD大于2.0，一般要稀释后再测，而不能根据之前的检测结果稀释，因为OD太大了就会超过检测范围，灵敏度显著降低。4、OD值是透光率，跟体积没关系，只跟菌浓度有关系，而且只有在一定的吸光值范围内成线性关系，一般在范围内。第二十四页，共二十九页，2022年，8月28日双酶切时不要选择识别位点有部分重叠或者太靠近的酶！M13F：5’-gTAAAACgACggCCAgTg-3’

M13R：5’-ggAAACAgCTATgACCATg-3’第二十五页，共二十九页，2022年，8月28日载体单酶切：酶切后需要进行脱磷，防止载体自连，而且连接后外源片段插入的方向不能固定，只能通过酶切检测或者测序判断。载体双酶切：外源片段插入的方向是固定的，由目的片段两侧的酶切位点（往往通过PCR引物加入的酶切位点所确定，但要注意选择的两种酶在多克隆位点里有一定的距离，最好识别位点不要相互重叠，否则会造成酶切困难。载体单酶切和双酶切的注意事项NotI：GCGGCCGCXbaI：TCTAGASpeI：ACTAGTCGCCGGCGAGATCTTGATCA第二十六页，共二十九页，2022年，8月28日NotI：GCGGCCGCXbaI：TCTAGASpeI：ACTAGTCGCCGGCGAGATCTTGATCACleavageClosetotheEndofDNAFragments(linearizedvector)"BasePairsfromEnd"referstothenumberofdouble-strandedbasepairsbetweentherecognitionsiteandtheterminusofthefragment;thisnumberdoesnotincludethesingle-strandedoverhangfromtheinitialcut.第二十七页，共二十九页，2022年，8月28日外源片段克隆到载体里的策略和步骤1、根据实验目的选择合适的载体；2、分析外源目的片段的酶切位点（找absentsite，分析软件：如