实验二PCR不跑电泳

实验二PCR不跑电泳第一页，共三十一页，2022年，8月28日PCR的种类和PCR仪普通PCR梯度PCR实时荧光定量PCRLongGeneABIBio-radEppendorf第二页，共三十一页，2022年，8月28日全触摸屏PCR仪（Bio-Rad）第三页，共三十一页，2022年，8月28日什么是聚合酶链式反应（PCR）？聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。第四页，共三十一页，2022年，8月28日Khorana(1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”1985年，KaryMullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片段；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。第五页，共三十一页，2022年，8月28日第六页，共三十一页，2022年，8月28日20212223N:MolecularnumberN0:Originalnumbern:CyclesE:efficiencyN=N0X2nPCR的指数扩增N=N0X（1+e)n第七页，共三十一页，2022年，8月28日第八页，共三十一页，2022年，8月28日PCR扩增过程DNA模板变性退火:引物+模板新链延伸50~60℃72℃30-40次循环引物耐热的DNA聚合酶退火温度：45-60℃延伸时间：1-2kb/min循环数：30-40第九页，共三十一页，2022年，8月28日PCR试剂的作用及使用浓度范围1、DNA模板(template)：λ

噬菌体的质粒DNA(几纳克~几微克)2、dNTP:4种dNTP混和物。20-200umolL。大于50mmol/L可抑制Taq酶的活性。3、10×PCR缓冲液(buffer):组分如下:

15mmol/LMgCl2（影响引物退火和解链的温度，影响产物的特异性，影响引物二聚体的形成。浓度范围：。浓度太低无PCR扩增，太高则会出现非特异性扩增）

500mmol/LKCl(有利于引物与模板退火，浓度太高则抑制酶活性)、

100mmol/LTris.HCl(pH8.3)（缓冲PH）

0.1%明胶（稳定酶的活性）4、引物(primer):上游引物（M13F），下游引物（M13R）（引物终浓度：）6、TaqDNA聚合酶第十页，共三十一页，2022年，8月28日《分子克隆3》提供的PCR标准反应条件：模板1pg-1μg引物1μmol/LDNA聚合酶1－5单位Mg2＋1.5mmol/LdNTPs200μmol/LKCl50mmol/L第十一页，共三十一页，2022年，8月28日影响PCR反应的关键因素1.引物的质量与特异性；2.

PCR循环条件（退火温度）；3.Mg2+浓度；4.模板DNA的质量；5.酶的质量。第十二页，共三十一页，2022年，8月28日DNA模板模板浓度：0.01-1ng（plasmid,phage）；0.1-1ug（genomicDNA）；10倍稀释（cDNA）;模板中是否含有蛋白质杂质模板中是否含有Taq酶抑制剂（苯酚）第十三页，共三十一页，2022年，8月28日Enzymeconcentration

TaqDNApolymeraseisbetween1and2.5units.

催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少dNTP

Aworkingstockcontaining1mMeachdNTPisrecommendeddNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，多次冻融会使dNTP降解。第十四页，共三十一页，2022年，8月28日Mg2+浓度：

0.5-2.5mM较合适。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。引物浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。第十五页，共三十一页，2022年，8月28日变性温度和时间

：94-95Cfor30seconds。

变性不完全,往往使PCR失败，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。退火温度：

通常PCR的退火温度选择为Tm-5oC;

退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。

引物为20mer以下时：Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C)

引物为20mer以上时：Tm=81.5十0.41×(GC％)-600/L其中L为引物的长度。第十六页，共三十一页，2022年，8月28日

延伸时间：1-2kb/min.

延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。

循环数：

35cycles

循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。第十七页，共三十一页，2022年，8月28日退火温度对PCR产物量和特异性的影响第十八页，共三十一页，2022年，8月28日PCR常见问题假阴性：

无扩增条带（漏加模板、引物或酶；酶失效等；引物不合适）假阳性：非特异性扩增带（退火温度偏低；引物不合适；Mg2+浓度不合适）；

第十九页，共三十一页，2022年，8月28日为什么可以通过PCR扩增得到特异片段模板DNA1st2nd3rd特异性扩展片段%=0%特异性扩展片段%=25%特异性扩展片段%=50%4th特异性扩展片段%=68.75%.....第二十页，共三十一页，2022年，8月28日PCR的特点简便、快速一次性加好反应液，1～3小时完成扩增，扩增产物一般用电泳方法即可检测分析对标本的要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等的粗提DNA灵敏度高理论上1～3个DNA分子经PCR扩增可获得百万以上个相同的DNA分子特异性强扩增的产物与模板分子特异区域完全相同第二十一页，共三十一页，2022年，8月28日PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤检测和诊断，转基因产品的检测，动植物检疫法医犯罪现场标本分析其他……第二十二页，共三十一页，2022年，8月28日实验材料与试剂1、DNA模板(template)：λ

噬菌体的质粒DNA2、dNTP:4种dNTP混和物3、10×PCR缓冲液(buffer):组分如下:

15mmol/LMgCl2

500mmol/LKCl100mmol/LTris.HCl(pH8.3)

0.1%明胶4、引物(primer):上游引物（M13F），下游引物（M13R）（见“实验指导”）6、TaqDNA聚合酶(Taqpolymerase)

第二十三页，共三十一页，2022年，8月28日PCR的基本步骤1、PCR反应体系的建立取0.2ml的薄壁离心管，按表1顺序加入试剂→稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。2、PCR的变温程序（热循环反应）按表2设置PCR反应的变温程序→把离心管放进PCR仪进行扩增→反应结束后低温保存或检测3、PCR扩增产物的电泳检测(下次实验)第二十四页，共三十一页，2022年，8月28日PCR的基本步骤1、PCR反应体系的建立（2人一组）取0.2ml的薄壁离心管，按表1顺序加入试剂→稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。试剂标记成份1份体积(μl)H2OddH2O17.3Buffer10×反应缓冲液2.5dNTPdNTPs(2.5mMeach)2P1引物1（10uM）1P2引物2（10uM）1DNAλDNA1rTaqrTaq酶0.2总体积25表1PCR反应体系第二十五页，共三十一页，2022年，8月28日2、PCR的变温程序（热循环反应）

按表2设置PCR反应的变温程序→把离心管放进PCR仪进行扩增→反应结束后低温保存或检测反应阶段循环数

温度持续时间1194℃（预变性）3min23594℃（变性）30s52℃（退火）30s72℃（延伸）30s3172℃（补充延伸）10min4112℃置于12℃可短时间保存PCR产物；若需长时间保存取出后置-20℃保存表2PCR反应的变温程序第二十六页，共三十一页，2022年，8月28日引物设计第二十七页，共三十一页，2022年，8月28日PCR引物设计的原则引物长度：16-30nt(20±2nt)G+C%：40-60%四种碱基应随机分布，在3’末端不存在连续3个G或C在引物内，尤其是在3’端不应存在二级结构（引物内互补配对）两个引物之间，尤其是3’端不能互补。两引物间最好不存在4个连