第四章酶的分离纯化

Chapter4

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的提取、分离和纯化1Contentsofchapter4第一节酶的提取与分离纯化技术路线第二节细胞破碎第三节酶的提取第四节酶的分离方法GoGoGoGo第五节酶的浓缩、干燥与结晶Go第六节纯化方案的设计与评价Go2第一节酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。3酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crudeprotein):取样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用

盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各种

柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化不同阶段4第二节细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机5机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理6利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。用于破碎动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞，也可以用于微生物，特别是细菌细胞的破碎。利用研钵、石磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。可以加入精制石英砂、小玻璃球、氧化铝等作为助磨剂。常用于微生物和植物组织细胞的破碎。7细胞对破碎方法的敏感性细胞声波机械渗透压冻融————————————————————动植物++++++++++++革兰氏阴性菌++++++++革兰氏阳性芽孢菌

++++++酵母++++革兰氏阳性球菌+-++菌丝-++-++孢子----8有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。9细胞破碎确认

1.直接测定破碎前后的细胞数：

破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。10酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。第三节酶的提取11提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。采用低温下（0--10℃）操作。12一、酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶13盐溶:当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。盐析:当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子，相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。141516二、影响提取的主要因素1、温度

提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般来说，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，这容易引起酶的变形。在不影响酶的活性的条件下适当提高温度，有利于酶的提取。2、Ph

在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过高或过低，以免引起酶的变形失活。173、提取液体积增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总用量为原料体积的3-5倍。在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来。18第四节酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go6、萃取分离Go191、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离201.1盐析

Ks分段盐析：在一定的温度和pH值条件下（β为常数），利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值)使不同的酶或蛋白质分离的方法。Ks：代表盐析效率。其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。β：表示温度一定时，离子强度为0时某一蛋白质的溶解度.β分段盐析：在一定的盐和离子强度的条件下（I为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法。通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。2122有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等，丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。介电常数:介质在外加电场时会产生感应电荷而削弱电场，原外加电场(真空中)与最终介质中电场比值.1.2有机溶剂沉淀（降低介电常数）23优缺点：

优点：1）分辨率比盐析法高

2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

影响因素：（1）温度：低温（0℃）操作。（2）pH值：尽可能靠近其等电点。（3）离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度目的防止蛋白质变性（4）蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml24252、离心分离

离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。26相对离心力以往离心机的转速常以每分钟多少转表示，现在常用相对离心力（RCF）表示。两者互换公式如下：RCF=1.2×10-5×R×N2N表示转速，单位为转/分(r/min);R表示离心半径，即离心管底端至轴心的距离，单位为厘米（cm）；RCF表示相对离心力，单位用重力加速度g（g＝9.8m/s）27常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。2.1离心机的选择常速离心机高速离心机超速离心机28高速离心机：最大转速为（1～2.5）×104r/min，相对离心力达到1×104～1×105g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。超速离心机：最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力可以高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。29303132离心管材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖332.2常用离心方法

差速离心法沉降速度法密度梯度离心沉降平衡法等密度梯度离心34（1）差速离心

（differentialcentrifugation）

采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。

优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。2）贴壁严重。3）沉降的颗粒受到挤压。35

差速离心分离示意图（a）离心前的悬浮液（b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况

3637（2）密度梯度离心

（densitygradientcentrifugation）

样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。

特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。3839密度梯度离心

步骤：A.形成密度梯度B.加样C.离心D.收集样品40Densitygradientultracentrifugation41（3）等密度梯度离心

又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。特点：

介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。42根据颗粒间存在密度差异，在梯度液中进行离心分离时颗粒到达各自等密度区域后就不再移动了，形成一层层颗粒区带。等密度梯度分为自成形梯度与预成形梯度。自成形梯度是将梯度介质与样品混在一起，通过离心，介质形成密度梯度，样品颗粒分布在各自不同等密度位置上。预成形梯度是预先将梯度液按下重上轻铺置于离心管内。它又分线性梯度与阶梯梯度。线性梯度由梯度仪制备或阶梯梯度经过扩散作用而形成，阶梯梯度多用手工铺置而成。43

等密度梯度离心示意图

（a）离心前；（b）离心后

44密度梯度离心等密度梯度离心梯度介质通常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降样品通常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降样品离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度分离依据密度相近，但沉降系数不同沉降系数相近，但密度不同沉降速度离心和沉降平衡离心的特点45总结：等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。463、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质47膜分离

借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离加压膜分离微滤超滤反渗透电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析483.1加压膜过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同

)

类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜49微滤(Microfiltration，MF)一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞50超滤(ultrafiltration，UF)

一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。

51常规过滤(A)和超滤(B)的示意图

AB52反渗透（Reverseosmosis，RO）

利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。53渗透与反渗透54ReverseOsmosis(RO)Nanofiltration(NF)Ultrafiltration(UF)Microfiltration(MF)553.2扩散膜分离--透析（dialysis）溶质分子Y从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动56蛋白质透析57透析方法及装置

透析袋透析简单装置。A:透析夹，B:透析，C:透析示意图

583.3电场膜分离（1）电渗析：在外加直流电场的作用下，利用膜的选择透过性，使离子从一部分水中迁移到另一部分水中的物理化学过程。

＋—电渗析半透膜（2）离子交换膜电渗析：用离子交换膜代替一般的半透膜。应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。594、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。60色谱起源色谱组分色素石油醚碳酸钙颗粒

用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)。61层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离62吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离混合物中各组分的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。

4.1吸附层析6364654.2分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，分配系数是一常数。66

在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。纸上层析分配薄层层析分配气相层析6768离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离的一种层析分离方法。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。4.3离子交换层析697071凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。4.4凝胶层析7273747576凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）77凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰Ⅰ.Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。Ⅲ.其它组分0<Kd<1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。782.常用凝胶1)交联葡聚糖凝胶（dextrangel)商品名:Sephadex型号SephadexG－10至G-200G后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。792）琼脂糖凝胶（agarosegel)商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美国）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。803）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）

商品名为Bio-Gel,型号从Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔径也越大。以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。81亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.4.5亲和层析82配基83亲和层析的四个要素84Affinitychromatography85根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：

分子对亲和层析免疫亲和层析

共价亲和层析疏水层析

金属离子亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析

8687大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心，欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobicpatch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。疏水层析原理:88在高盐浓度下，蛋白质发生局部可逆变性，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。89904.6层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的层析技术。在层析系统中，柱内装上多缓冲离子交换剂，当加进两性电解质载体的多缓冲溶液流过层析柱时，在层析柱内形成稳定的PH梯度。欲分离酶液中的各个组分在此系统中会移动到（聚焦于）与其等电点相当的位置上，从而使不同等电点的组分分离。91在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。+-5、电泳分离颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。925.1电泳的分类按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。

以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。

93③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。94水平板式电泳槽垂直板式电泳槽955.2SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）的一种最好的办法。96SDSseparatesproteinsbyMw97原理：

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。98两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。991001015.3等电聚焦

(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续

pI

的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。102原理

两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。103两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度。(2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。(3)分子量小——电泳后易分离除去。(4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。(5)与样品中的化学组分不会发生化学反应。104等电聚焦电泳1056、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为：

有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取

反胶束萃取

1066.1双水相萃取，又称水溶液两相分配技术（partionoftwoaqueousphasesystem）

用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran），浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系，由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。

107双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。由于聚合物分子的空间阻碍作用，使他们无法相互渗透，不能形成均一相，从而有相分离的倾向。108各种双水相系统聚合物P聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纤维素羟甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羟乙基纤维素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠1091106.2反胶团萃取（1）反胶团：又称反胶束（ReversedMicelles）指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。

反胶团模型亲水基团向内聚集111112（正）胶束反胶束形成表面活性剂溶于水，使其浓度超过临界胶束浓度。表面活性剂溶于非极性溶剂，使其浓度超过临界胶束浓度。构造表面活性剂极性基团在外，非极性基团在内，形成非极性核心。表面活性剂非极性基团在外，极性基团在内，形成极性核心，溶于水后，形成水池（waterpool）。功能溶解非极性物质溶解极性物质113p154114（2）萃取过程第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。1157超临界流体萃取超临界流体是介于气液之间的一种既非气态又非液态的物态，这种物质只能在其温度和压力超过临界点时才能存在。超临界流体的密度较大，与液体相仿，而它的粘度又较接近于气体。因此超临界流体是一种十分理想的萃取剂。116超临界流体的性质

1）超临界流体条件下的溶解度溶质在一种溶剂中的溶解度取决于二种分子之间的作用力，这种溶剂一溶质之间的相互作用随着分子的靠近而强烈地增加,相互作用随着分子的靠近而强烈地增加，也就是随着流体密度的增加而强烈的增加。2)传递性质值的范围在气体和液体之间临界流体中的扩散系数比在液相中要高出10-100倍,但是黏度就比其小10-100倍.117超临界流体的溶剂强度取决于萃取的温度和压力。改变萃取剂流体的压力和温度，就可以把样品中的不同组分按在流体中溶解度的大小，先后萃取出来.在低压下弱极性的物质先萃取，随着压力的增加，极性较大和大分子量的物质与基本性质.所以在程序升压下进行超临界萃取不同萃取组分，同时还可以起到分离的作用.118第五节酶的浓缩、干燥与结晶

一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩

通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。119（二）

超滤浓缩

超滤(ultrafiltration)浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。图4-61

酶的超滤浓缩

120（三）吸水剂

1.胶过滤浓缩：

利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。1212.聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称PEG

。

利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。122（四）反复冻融浓缩利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。

（五）沉淀法盐析法，有机溶剂法123二、酶的干燥在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥;冷冻干燥;喷雾干燥;气流干燥;吸附干燥等。

酶的干燥多采用冷冻干燥法。

将酶溶液在较低温度下（-10℃~-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。

124125三、酶的结晶

结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。

126

晶体沉淀——分子排列有规则蛋白质沉淀

非晶体沉淀——分子排列无规则（无定形沉淀）

晶体内部有规律的结构决定了晶体的形成必须是相同的原子、离子或分子。

过饱和溶液的形成是结晶的原推动力和首要条件。

127（一）结晶的条件酶的纯度

纯度越高越易结晶（>50％

）

2.酶的浓度（恰到好处）

浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。3.结晶温度4.溶液pH5.离子强度

6.晶核

7.结晶时间128（二）结晶的方法

1.除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达到过饱和状态而析出晶体;2.不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，如中性盐、有机溶剂等。盐析法如，前述的有机溶剂法均可用于结晶等电点

129常用的结晶方法：透析平衡结晶法将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）。酶液要浓缩到一定浓度。130Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）一、设计分离纯化工艺的基本要求第六节纯化方案的设计与评价131二、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异调节溶解度：沉淀法2.根据分子大小、形状的不同：

离心分离，膜分离，凝胶过滤3.根据分子电荷性质的不同：

离子交换层析，电泳4.根据专一性结合的方法：亲和层析5.其它：吸附层析，疏水层析132133（二）纯化方法的排序

先选用粗放、