实验生物显微制片技术

实验生物显微制片技术第一页，共二十二页，2022年，8月28日实验目的与要求1.理解石蜡切片法各主要步骤的基本原理。2.掌握各种试剂的配制和各种器材的使用方法。3.掌握石蜡切片法的具体操作方法。4.熟悉实验过程中应注意的事项。5.自己取材，植物、动物材料制备标本片。6.通过在显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标本，了解鱼肝细胞的显微结构。第二页，共二十二页，2022年，8月28日生物制片技术概述生物显微制片技术是观察研究细胞、组织、胚胎、动物等的形态、结构及病理变化的重要方法。由于生活时的生物体器官组织过大或过厚不能在光学显微镜下观察，或者能放在光学显微镜下，光线也不能透过，而且一些微细结构的折光率相同，即使光线能够透过也看不清楚。因此，就必须运用显微技术中各种方法将其制成玻片标本，使组织细胞既能在光学显微镜下观察又可长期保存，结构对比变明显。一般可分为切片法和非切片法两类制片方法。第三页，共二十二页，2022年，8月28日切片法：石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法等。非切片法：包括整体封藏法；涂布法；压片法，此外还有铺片、磨片等。显微制片需经历一系列操作，相当细致而复杂，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，手脑并用。切片法：取材→固定→冲洗→脱水→透明→包埋→切片→染色→脱水→透明→封藏。非切片法：取材→固定→冲洗→脱水→透明→染色→脱水→透明→封藏第四页，共二十二页，2022年，8月28日切片法与非切片法比较切片法能显示出组织、细胞内部的微细结构,且对比非常明显清晰。但操作步骤多,手续复杂,制片速度慢,耗时较长。如洋葱根尖纵切片中对线粒体、有丝分裂的观察;小麦叶片横切和玉米叶横切中对细胞木质化细胞质、纤维素细胞质的观察。切片法是生物显微制片技术中最常用和最主要的方法,其中又以石蜡切片法最为重要。非切片法能保持生物体或某部分器官组织的原有状态及其完整性,但因不经过切片手续,不仅不能清晰地显示各器官组织之间的相互关系,更无法显示组织和细胞之间的结构关系。非切片法中整体切片法仅能对很小的材料制片,如人体口腔上皮装片,草履虫装片。涂片法仅对含有大量水分或完全为液体的组织或器官适用。第五页，共二十二页，2022年，8月28日1非切片法1.1涂片法主要用于血液、精液、尿液、微生物液体培养物等不能用切片法制成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，还可再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。1.2铺片法主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。如:洋葱表皮细胞的铺片制备。第六页，共二十二页，2022年，8月28日1.3压片法一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖压片观察染色体。1.4磨片用于质地坚硬的组织，如骨和牙。1.5离析法此法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使组织分散成单个游离细胞。如植物去壁低渗法制备染色体标本。第七页，共二十二页，2022年，8月28日2切片法切片是供光学显微镜或电子显微镜观察的动植物组织薄片。

切片法是通过手工或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法。需先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤。第八页，共二十二页，2022年，8月28日2.1石蜡切片法石蜡切片法包括以下各主要步骤：取材→固定→洗涤和脱水→透明→浸蜡→包埋→切片与粘片→脱蜡→染色→脱水→透明→封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，标本片可以长期保存使用。第九页，共二十二页，2022年，8月28日详细步骤和各个环节要求取材：材料必须新鲜、完整，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，且避免挤压、挫伤而不能反映组织活体时的形态结构。注明采集时间、地点、名称、组织部位等。组织块大小以0.5×0.5×0.2cm为宜。固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。此外固定还有使组织硬化作用，助染作用。此外还有物理方法如干燥、高热和低温骤冷等方法固定。第十页，共二十二页，2022年，8月28日洗涤与脱水：洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多以流水冲洗。脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方可进行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能与水又能与透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游离的水。脱水剂常采用乙醇或丙酮、正丁醇、叔丁醇进行梯度脱水。每次时间为1～数小时。脱水的过程：通常从30％或50％乙醇开始，一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的收缩或变形。第十一页，共二十二页，2022年，8月28日

透明透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋介质（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂（乙醇），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏油等。一般过程为：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，溶蜡量大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，变脆。第十二页，共二十二页，2022年，8月28日浸蜡将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，梯度提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换组织块中的透明剂，便于之后的包理与切片。浸蜡要在温箱（60℃，液态石蜡）中进行，每级1-3h。包埋样品浸蜡后，内部间隙已完全被石蜡占据，接着还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以便切片。用镊子轻轻将浸蜡后的组织块夹入盛有液态石蜡的纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。可同时包埋多块组织。至此，组织材料的前处理过程已完成，可用于切片。第十三页，共二十二页，2022年，8月28日切片修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，再修整成正方体或长方体，从切面看组织周围的石蜡厚度相等(3mm)。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）上，以便于固定在切片机上。切片：调整切片机刀片位置与台木上的蜡面平行

。一手持毛笔，一手转动切片机，切下的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带根据需要切成数段，放在40℃水面上。贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。第十四页，共二十二页，2022年，8月28日第十五页，共二十二页，2022年，8月28日脱蜡、水化、染色蜡带必须先用二甲苯去除石蜡再用乙醇去除二甲苯，再进入水中，才能染色。染色的方法很多，要根据标本要求显示的目的选择不同的染剂，最常用的是苏木精-伊红染色（H·E染色）。苏木精使细胞核显深紫色，伊红使细胞质显粉红色，可显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。染色后再使带水的切片经历脱水→透明，最后用树胶封片。第十六页，共二十二页，2022年，8月28日HE染色：苏木精（Hematoxylin）伊红（Eosin）染色碱性染料将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色酸性染料将嗜酸性物质（本身碱性）染成红色细胞核中的DNA、RNA细胞质中的RNA细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网）第十七页，共二十二页，2022年，8月28日(l)细胞核染色剂用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。

(2)细胞质染色剂用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。（3）脂质染色剂用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。第十八页，共二十二页，2022年，8月28日其步骤如下：二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→苏木精染液→0.01%盐酸→0.01%氢氧化钠→蒸馏水→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→伊红染液→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→二甲苯→二甲苯→封片第十九页，共二十二页，2022年，8月28日镜检、贴标签、干燥、记录。第二十页，共二十二页，2022年，8月28日3石蜡切片实例——鱼肝制片材料：鱼肝（厚2-3mm，carnoy3-4h/bouin/Zenker固定24h）。试剂：固定液，埃里希苏木精染液，1%伊红水溶液，1%盐酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，30%~100%各级乙醇，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。苏木精为碱性染料（含阳离子），伊红为酸性染料，鱼肝细胞核含酸性物质，易与碱性染料的阳离子结合染上蓝色，胞质含碱性物质，易与酸性染料中阴离子结合而染上粉红色。第二十一页，共二十二页，2022年，8月28日实验程序：取材（2-3×5×5mm3）→固定（carnoy3-4h，bouin12-24h）→洗涤（70%乙醇3-5次）→脱水（80%、90、100、100%乙醇各0.5h）→透明（乙醇+二甲苯等量混合15min，二甲苯15min2次）→透蜡（二甲苯+石蜡各半35-37℃,0.5h，石蜡56-60℃,0.5h2次）→包埋（凝30min）→切片（8μm，水面展开）→贴片（涂粘片剂，滴水1滴）→展片（40-45℃）→烘干（37℃，24h）→脱蜡（二甲苯2-5min，二甲苯+乙醇2-5min）→复水（100%、90、80、70、50%、蒸馏水各2min）→染色（埃里希苏木精染液15-20min）→水洗（2.5min