核酸提取与鉴定

核酸的提取与鉴定研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等过程：

核酸提取裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中

纯化：使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离

核酸提取的主要步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜——内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中

总原则：

①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。鉴定：浓度、纯度、完整性鉴定技术：分光光度技术、凝胶电泳技术

第一节预处理

一、样品预处理

1、组织

组织有新鲜组织、甲醛固定或石蜡包埋组织。

新鲜组织先用生理盐水洗，然后将其捣碎或剪碎，加液氮研磨成粉状，加细胞裂解液裂解细胞；

甲醛固定组织要先去掉甲醛；

石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。2、培养细胞

培养细胞需弃细胞培养液，用缓冲液进行多次漂洗，方可用于提取核酸。

3、血液血液可以是新鲜血液或者冻贮血液；注意抗凝剂的选择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸钠，不可使用肝素；全血离心弃血清（或血浆）、加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解红细胞，再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA释放出来。二、提取用具预处理（一）DNA提取用具的处理试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。（二）RNA提取用具的处理1、提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)。玻璃用品：使用前于180℃的高温下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。

所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。

在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。2．RNA提取中RNase污染的控制

第二节DNA的提取

一、DNA的常规提取真核生物DNA主要以核蛋白形式(DNP)存在于细胞核中，因此要从细胞中提取DNA时，必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使核蛋白释放，再把蛋白质除去，再除去细胞中的糖类，脂类、RNA等物质，沉淀DNA,去除盐类，有机剂等杂质,得到纯化的DNA。1、酚-氯仿提取法

2、浓盐法

核糖蛋白（RNP）与脱氧核糖蛋白（DNP）在不同浓度的NaCl溶液中溶解度显著不同。DNP在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最小，仅为水中的1％。当NaCl浓度增至1mol/L时，DNP的溶解度比在水中大2倍。利用这一性质可将DNP从破碎后的细胞匀浆中分离出来，也可以使DNP和RNP分离，DNP的蛋白部分可用苯酚、SDS等其他方法将其除去。

3、玻璃棒缠绕法用盐酸胍裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个代沟的或前端为U型的玻璃棒在这两层溶液的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并与室温下蒸发乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸入TE缓冲液中，使其重新吸水膨胀而和玻璃棒分离。4、玻璃颗粒吸附法

首先利用含异硫氰酸胍的细胞裂解液裂解细胞，然后加入能够与DNA结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以和DNA结合，一定大小的硅胶颗粒也可以和DNA结合。二、质粒DNA的提取（1）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。（2）小的1-3kb，大的可达数百kb。（3）进入细菌，可自我复制或表达。质粒DNA的提取有效方法方法：碱裂解法；氯化铯密度梯度分离法；煮沸裂解法等。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。1、培养细菌和扩增质粒

用氯霉素抑制宿主细胞的蛋白质合成，从而抑制染色体的复制和分裂；质粒的复制系统成分的半衰期较长，使质粒得以扩增。2、收获细菌和溶菌细菌裂解三种方法：机械法（如超声波等）化学试剂法（如SDS等）溶菌酶－化学试剂联合法（最常用）3、提取质粒主要使染色体DNA与质粒DNA分离

分离主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象。

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来（1）碱裂解法（2）氯化铯密度梯度分离法

EB分子可嵌入碱基对之间，使DNA解旋开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋，可结合大量EB，DNA-EB复合物含EB越多，密度越小。闭环质粒DNA没有游离末端，不易解旋，结合少量EB，密度较大。在饱和EB条件下，质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大，经氯化铯密度梯度离心，可分离提取质粒DNA。（3）煮沸裂解法通过加热，使细菌裂解、蛋白质和染色体DNA变性。降低温度，闭环质粒DNA复性留于上清液，染色体DNA不能复性与变性蛋白质形成沉淀，可通过离心出去而分离。第三节RNA的提取一、总RNA的提取所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶的活性。常用的RNA酶抑制剂

①焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。②异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂。③氧钒核糖核苷复合物④RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)⑤其他：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。RNA的提取方法

1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法

使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性，再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA。本法已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。

2、盐酸胍-有机溶剂法盐酸胍变性蛋白质，抑制RNA酶，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA。此法适用于没有超速离心设施的情况下提取细胞总RNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。3、氯化锂-尿素法利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，氯化锂选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA，如5sRNA等。优点是快速、简便、产量高，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取。4、一步快速热酚抽提法将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠（SLS）等联合使用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离；然后用苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。

二、mRNA的提取

从提取的总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）-柱层析法分离：mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再通过低盐浓度洗脱mRNA而分离。第四节核酸的鉴定一、核酸浓度检测1、定磷法DNA和RNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9.4%，DNA的平均含磷量为9.9%，因此可从样品中测得的含磷量来计算DNA或RNA的含量。

2、定糖法RNA含核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对DNA和RNA进行定量测定。3、紫外吸收法DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时，样品中双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40μg/ml。DNA(μg/μl)=A260×50×稀释倍数/1000RNA（μg/μl）=A260×40×稀释倍数/1000二、核酸纯度检测

核酸的纯度用A260/A280比值表示。OD260/OD280

＝1.8——为DNA纯品OD260/OD280

＝1.8~2.0——为RNA纯品三、核酸完整性检测核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三条带，其中28srRNA的亮度应为18srRNA的两倍，5srRNA较弱。

基因组DNA抽提结果电泳图总RNA抽提结果电泳图mRNA第五节电泳根据电泳支持介质分：琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段（0.1～60kb），特别是分子量测定聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于鉴定较小的核酸片段，特别是DNA测序电泳的基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如蛋白质、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离、纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将适量的琼脂糖粉末悬浮于缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度(％)线型DNA分子的分离范围(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶电泳装置DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。RNA可以使用非变