多聚酶链式反应扩增DNA片段课件2014年3月

DNA指纹是从血液或其他组织中提取基因的DNA，用特定方法把DNA切割成很多长短不等的片段，把这些片段通过电泳的方法按长短分开，然后转移，固定和杂交.这些杂交的片段可以通过放射自显影或染色处理显示出来，形成图谱，一般包含15-30条带(即杂交片段)，肉眼可辨.不同个体的图谱是不同的，就像人的指纹一样互不相同.而同一个体的不同生长发育阶段和不同组织的DNA指纹是相同的.所以，它既有高度的个体的特异性，同一个体又是一致和稳定的.从一滴血，一根毛发，精液，几个皮细胞等小样品，甚至从鼻中黏膜，唾液，长久的尸骨都能随时做DNA指纹分析.

DNA指纹是从血液或其他组织中提取基因的DNA，用特定方法把DNA切割成很多长短不等的片段，把这些片段通过电泳的方法按长短分开，然后转移，固定和杂交.这些杂交的片段可以通过放射自显影或染色处理显示出来，形成图谱，一般包含15-30条带(即杂交片段)，肉眼可辨.不同个体的图谱是不同的，就像人的指纹一样互不相同.而同一个体的不同生长发育阶段和不同组织的DNA指纹是相同的.所以，它既有高度的个体的特异性，同一个体又是一致和稳定的.从一滴血，一根毛发，精液，几个皮细胞等小样品，甚至从鼻中黏膜，唾液，长久的尸骨都能随时做DNA指纹分析.

DNA指纹技术在法医学鉴定中的应用由犯罪现场残留的血、精液、唾液、毛发等成分提取的DNA指纹与嫌疑犯的DNA指纹对照。谁是凶手？英国遗传学家Jefferys通过DNA分子生物学实验方法获得了一系列可以在胶片上看到的图纹，这些图纹极少有两个人完全相同，与人的指纹一样是每个人所特有的.故称为“DNA指纹”1、将毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等所含的DNA提取出来2、将DNA样品进行PCR扩增。3、选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNA位置上加以切割，将分子量很大的DNA长链切成许多长度不同的小片段。4、在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNA片段进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。5、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNA片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，并永久性地固定在尼龙膜上。6、让放射性DNA探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行杂交。DNA指纹还用于亲子鉴定、空难事故受难者残骸鉴定等。山西省公安厅24小时出结果，100%准确5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段应用：

的诊断、

、

、

和DNA

等各方面。遗传疾病刑侦破案基因克隆序列测定了解应用理解原理放什么物质？创设什么条件？为什么？古生物学

PCR美国科学家穆利斯(K.B.Mullis)1988提出的体外以极少数的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA的方法。1993年获诺贝尔奖。解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。快速、高效、灵活、易操作。特点：PlymeraseChainｒｅａｃｔｉｏｎDNA分子的-OH端为3/;磷酸基团的末端为5/3’3’5’5’一、基础知识（一）PCR原理1、细胞内DNA的复制（1）DNA由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的。？两个脱氧核苷酸通过3-5磷酸二酯键连接识别解旋：形成子链:解旋酶催化，氢键断裂以母链为模板，在DNA聚合酶的催化下，利用游离的脱氧核苷酸进行碱基配对母链子链子代DNA1、细胞内DNA的复制（2）复制所需的物质及作用：方向？还需什么物质？DNA聚合酶特性？作用？引物？（３）子链形成不能从头开始合成子链，只能催化从引物的游离3’一OH上连接脱氧核苷酸形成磷酸二酯键。按5’→3’的方向延长。一小段单链的DNA或RNA，能与母链的一段碱基序列互补配对。通常为20—30个核甘酸方向？引物DNA聚合酶1、细胞内DNA的复制（小结）模板

亲代DNA解开双链解旋酶子链形成DNA聚合酶引物原料四种脱氧核苷酸能量ATP过程及需要的物质？高温为什么能使DNA解旋？耐高温的DNA聚合酶如何筛选？引物结合、DNA聚合酶最适温度是多少?体外合成DNA？需扩增的DNA高温90—95℃DNA聚合酶（耐高温）人工合成引物

四种脱氧核苷酸ATPDNA双链单链变性（加热80-100℃

）复性（缓慢冷却）2、DNA复制的人工控制（1）DNA的热变性——控制温度控制解旋与结合

（2）耐高温的TaqDNA聚合酶从水生耐热细菌中筛选。提高了效率，PCR趋于自动化.DNA聚合酶最适温度是70—75℃高温为什么能使DNA解旋？引物结合、DNA聚合酶最适温度?耐高温的DNA聚合酶如何筛选？(利于引物与母链结合，55℃最好)94℃最好)3.PCR需要的物质及条件6）自动调控控制温度的仪器，使DNA变性（90—95℃）复性（55℃）延伸72℃。1）需扩增的模板DNA2）耐高温的DNA聚合酶3）与两条模板链互补的引物4）原料（四种脱氧核苷酸）5）一定的缓冲液

放什么物质？什么条件？为什么？什么是PCR的三步曲？（1）PCR循环--变性94℃变性（二）PCR三步曲条件及结果？（1）PCR循环--变性（1）PCR循环--变性94℃变性（2）PCR循环—复性（退火）55℃复性（3）PCR循环—延伸（3）PCR循环—延伸PCR预变性变性94℃30s延伸72℃1min退火55℃30s94℃5min控制温度变化的温控设备1）需扩增的模板DNA2）耐高温的DNA聚合酶3）与两条模板链互补的引物4）原料（四种脱氧核苷酸）5）一定的缓冲液复制n次，要放多少原料和引物？引物特点？形成多少产物？产物完全相同吗？疑问第一次解旋高温的时间长？模板链会结合吗？MULLIS教授是个兴趣广泛，爱好户外活动、性格特殊的人，一次外出的返家途中，他驾驶着汽车在一条弯曲的山路上，在汽车开始驶入平坦笔直的公路时，他突然联想：已经经过的山路好像是折叠缠绕的DNA双螺旋，被热变性成两条解开的5‘→3’的单链就是山脚下平坦笔直的上车道，它们可以是DNA合成的模板，如果正在行驶的小汽车代表了一小段DNA引物，加入的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸.正是他开汽车时的联想，使他以后发明了PCR..(1)在合适位置写出在复性步骤中另种引物。

HO—A—G—5′(2)某同学设计的两组引物都不合理，请分别说明理由。②引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效(三）难点解析1、引物引物之间及引物内部碱基勿互补特点？种类？书写？2种

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为

。②在第

轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(三）难点解析1、引物2n2nX2—2DNA的数量=需要引物的数量=15/163数量？产物链的长短？第几次循环有短产物链？第几次出现两条均为短产物？两条均为短产物的数量公式？2；3；2n—2nPCR：在TaqDNA聚合酶的作用下，只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列；子代DNA单链中只有两条无引物，其余均含引物。处于两引物之间的DNA序列呈指数增长。2、产物链的长短。达标测评1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？从子链的5’端向3’端延伸“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个：A、2B、4C、6D、8（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（要更换枪头）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好P