chapter4酶的提取与分离纯化

酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化：

是指把酶从组织、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。制作：何正波本章学习目标和要求掌握：

细胞破碎方法;酶的提取操作;离心方法的分类;膜分离技术;盐析沉淀分离法;离子交换层析原理、操作;离子交换层析柱划分依据;凝胶层析原理及分类;电泳分离原理、影响因素.熟悉：

亲和层析原理;凝胶电泳、等电聚焦电泳原理及分类.

了解：各分离方法的类别;酶的结晶方法分类;酶的浓缩与干燥方法.

根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:（1）分离纯化用的原料来源要方便，成本要低；

目的蛋白质的含量、活性相对要高；可溶性和稳定性要好；

基因分子学的背景知识要有深入的了解；如果是重组蛋白表达系统，表达水平及表达方式均要确定。（2）防止酶的变性失活

破碎细胞的条件要尽可能地温和；

尽早尽可能多地去除各种杂质、脂类、核酸及毒素；使用极性条件要以目的蛋白质的活性和功能不受损害为原则；

低温和洁净的环境必不可少；要避免和防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、去污剂、高温、剧烈的机械作用和自身毒素等诸多因素。（3）缓冲溶液

操作缓冲溶液中的物质成分要谨慎考虑，避免随意性;

除去对可溶性及缓冲容量的考虑之外，蛋白水解酶和核酸酶抑制剂、抑制微生物生长的杀菌剂、稳定蛋白质构象和酶活性的还原剂及金属离子等均应依不同蛋白质和酶的性质、结构予以周全考虑。（4）检测手段

建立灵敏、精确、特异的检测手段是评估纯化方法、判断目的蛋白质产率、活性、纯度的前提。

酶活性检测可根据特异性底物的反应；其它目的蛋白质的检测在未能建立特异性的免疫学检测方法之前不仅要检测它总生物活性，还要有相应判定指标，保证检测的特异性.（5）纯化策略的选择应该选择不同机制的分离单元（方法）组成一套工艺；

应将含量多的杂质先分离去除；应尽早采用高效分离手段；

将最昂贵、最费时的分离方法放在最后阶段。也就是说，通常先运用非特异、低分辨率的操作方法，如沉淀、超滤和吸附层析等，这一阶段的主要目的是尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质；随后是高分辨率的操作方法，如具有高选择性的离子交换色谱和亲和层析，而将凝胶过滤层析这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可使分离效率提高。Contentsofchapter41、酶的提取与分离纯化技术路线2、酶溶液的制备3、酶的提取8、酶的制剂与保存7、酶的浓缩、干燥与结晶GoGoGoGoGo6、酶的分离方法Go4、酶溶液的絮凝、净化与脱色Go5、酶溶液的浓缩Go第一节酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。生物材料AB纯化阶段分析方法酶提取蛋白粗分级AmmoniumsulfateOrganicsolvent层析粗蛋白GelfiltrationIonexchangeAffinitychromatographyFPLC电泳PreparativeelectrophoresisIsoelectricfocusing部分纯化纯酶均质酶Protein/ActivityassayElectrophoresis:NativePAGESDSGradientPAGEKineticanalysisMolecularweightSedimentationcoefficientdeterminationQuaternarystructureIsoelectricfocusingPeptidemappingAminoacidanalysisAminoacidsequencingExtinctioncoefficient抗体Immunoassays:ImmunoblottingELISADoublediffusionImmunoelectrophoresis结晶X-raycrystallographySpectroscopicmethods:CDORDNMR&ESR生物材料的背景知识第二节酶溶液的制备

把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液。

酶溶液的制备包括：

材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽提液的浓缩等几个步骤。一.材料预处理及细胞破碎1.材料预处理

酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（游离酶和膜结合酶）。微生物胞外酶可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥；胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取；动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织等；植物材料应避免单宁等物质着色污染。

不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同。2.细胞破碎1、机械破碎法2、物理破碎法3、化学破碎法4、酶促破碎法机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理1）捣碎法

利用捣碎机高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶，芽等材料的破碎。

2）研磨法

利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。常用于微生物和植物组织细胞的破碎.

助磨剂：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝工业：高速珠磨机（High-speedbeadmill）如：Dyno-mill球磨机3）匀浆法（homogenization）

利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器的研杵的磨球和玻璃管内壁之间间隙常保持在十分之几毫米距离。破碎细胞的程度比组织捣碎机高。大型细胞破碎器：

Manton-Gaulin匀浆器主要是高压下使细胞通过小孔隙而被挤碎，每小时可处理数十升至数千升样品，适用于微生物发酵工业生产。对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法丝状真菌、较小的G+菌不宜用此法1）压力差破碎法

通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。高压冲击法、突然降压法（如：爆破性减压法）

、渗透压变化法2）温度差破碎法

利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。

反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎.

3）超声波破碎法（Ultrasonication）

利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法.特别适用于微生物细胞的破碎.

杆菌比球菌容易破碎

G-比G+容易破碎酵母菌不易破碎超声波细胞粉碎机高压细胞破碎机1）有机溶剂有机溶剂可以便细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，便胞内酶等细胞内物质释放到细胞外.应低温操作,以防止酶变性失活.如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等.2）表面活性剂：表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性.

一般采用非离子型的表面活性剂.如Triton,Tween等.化学破碎法

将细胞在一定的PH值和温度条件下保温一段时间利用细胞本身酶系的作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。

G+细菌肽多糖溶菌酶酵母β-葡聚糖

β-葡聚糖酶霉菌几丁质几丁质酶纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合使用对植物细胞具有良好的破碎效果.价格高，通用性差，产物抑制的存在酶促破碎法（Enzymaticlysis）（一）酶提取的方法（二）影响酶提取的主要因素二、酶的提取

大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐，稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。

盐溶现象/盐析现象

用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶.一般采用稀盐溶液进行酶的提取，浓度一般控制在0.02~0.5mol/L。常采用等渗溶液，即0.125mol/LNaCl和0.02~0.05mol/L（pH7.0~7.5）磷酸缓冲液或0.1mol/LTris-HCl。必要时，缓冲液中可加入EDTA（1~5mmol/L）、巯基乙醇（3~20mmol/L）等。例：

酵母醇脱氢酶用0.5mol/LNa2HPO4溶液提取。

6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/LNa2CO3溶液提取。枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/LMgCl2溶液提取。1、盐溶液提取例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取pH值与酶的稳定性相关，选择pH不能超出酶的稳定范围，从抽提效果而言pH值要偏离目的酶等电点，也就是说酶如果是酸性蛋白质则宜用稀碱溶液来抽提，反之碱性蛋白用酸来抽提。2、酸溶液提取例：细菌L-天冬酰胺酶可用pH11.0~12.5的碱溶液提取。3、碱溶液提取

一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水,稀盐,稀酸,或稀碱中,常用不同比例的有机溶剂提取。

如植物种子中的酶，一般用70%~80%的乙醇来提取。动物细胞微粒体中的酶用正丁醇来提取。

常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有亲水性和亲脂性。

例：琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等，用丁醇提取，都取得良好效果。4、有机溶剂提取1、温度

为防止变性失活,制备具有活性的酶,提取温度一般不易过高，一般在0℃~10℃的低温操作.

但如果抽提的酶比较稳定也可以用高温。如胃蛋白酶可以在37℃抽提。

酶的溶解度和稳定性与pH值有关.

首先考虑酶的稳定性；其次应远离等电点；一般选择pH4-6为宜。提取溶剂的pH应在酶的稳定范围内,为了提高酶的溶解度，提取时pH值应避开酶的等电点。2、pH值

在提取操作时适当加入底物或辅酶成分，可以改变提高酶的稳定性。为了防止蛋白酶的降解作用，可加入PMSF（苯甲基磺酰氟）；为防止氧化，则加入半胱氨酸或巯基乙醇。3、提取液的体积

一般为原料体积的3-5倍，最好分几次提取。4、辅助因子

含酶原料颗粒大小、搅拌、提取时间。搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用温和搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性失活.5、其他三、酶溶液的絮凝、

净化与脱色

由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困难；因此要用絮凝剂进行处理。（一）絮凝

絮凝剂有无机（如醋酸钙,磷酸钙,硫酸铝,氯化铝,硫酸铁,氯化铁等），有机（如聚丙烯酰胺等）和天然高分子（如壳多糖等）等多种类型。絮凝:

将溶液中不需要的成分通过絮状凝集的方式去除的过程.在此过程中用到的助剂称为絮凝剂（二）过滤或离心净化

通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。1、离心分离——从细胞抽提物中除掉固体离心机的选择：工业：连续流动离心机、间歇卸料的圆盘式离心机2、过滤——从细胞抽提物中除掉固体涡流膜过滤法（cross-flowmembranefiltration）（三）脱色

酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。四、酶溶液的浓缩冷冻干燥法：先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水分子从固体表面直接升华。蒸发法：目前工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。超过滤法：

将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。胶过滤法：

利用SephadexG-250或G-50吸水膨胀，而酶蛋白被排阻在胶的外面。其它方法：

吸水剂如用聚乙二醇(PEG)处理小量样品。干燥：

将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥。第三节酶分离纯化的方法一、酶分离纯化方法的选择

目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的。在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；严格控制操作条件，防止酶的变性失活。遵循原则：1、根据使用目的(工业用、分析用、医用）—质量要求；2、制备方法的经济性（符合步骤短、收率高、成本低的要求）；3、按蛋白质特性，操作要求：低温、pH(4-10)、表面变性、重金属、有机溶剂、水质、辅因子、蛋白酶等；4、根据酶的特点可采用：选择性变性、亲和性、酶活性测定等特殊手段。1、根据分子大小建立的分离纯化方法2、根据溶解度建立的分离方法3、按蛋白质电荷性质设计的分离方法4、根据亲和作用建立的纯化方法GoGoGoGo一、酶分离纯化方法的选择（一）根据分子大小建立的分离纯化方法

这类方法包括透析，超过滤，离心以及凝胶过滤等。

1、透析(Dialysis)法：原理：透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。透析袋的预处理：(1)将透析管剪成适当长度(10-20cm)的小段，即形成透析袋。(2)在大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10min。(3)将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。(4)将透析袋置1mMEDTA(pH8.0)中煮沸10min。(5)待透析袋冷却，存放于4℃，应确保透析袋始终浸没在液体中。

注：从此步起用透析袋时一定要戴手套操作。(6)在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。透析（dialysis）常用的透析袋类型：

再生纤维素膜透析袋纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（1102Da）；商品名为spectrapor等。过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；2.过滤类别截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金愿等微滤0.2~2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Ǻ~0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Ǻ生物小分子、盐、离子反渗透膜原理：

利用压力、抽滤或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，强行使水和其它小分子溶质通过膜，而所需的酶分子被滤膜截留，以达到浓缩和脱盐目的。超过滤(Ultrafiltration)法加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液超过滤（ultrafiltration）为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。制备超滤膜的材料：多是高分子聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数：截留分子量、耐受压力、滤速和有效过滤面积等；主要商品型号有AmiconDiaflo系列等。

超滤器类型：有管式，中空纤维式，螺旋卷绕式和平板式四种类型。（1）离心机的选择3、离心分离1）常速离心机又称低速离心机最大转速：8000r/min相对离心力：＜1×104gRCF=1.12×10-5×r×n2

RCF=相对离心力

r=旋转半径（厘米）n=每分钟转数主要用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣等固形物及粗结晶等较大的颗粒。2）高速离心机转速：

1×104－2.5×104r/min相对离心力（RCF）：

1×104－10×105g主要用途：分离各种沉淀物、细胞碎片、较大的细胞器等高速冷冻离心机3）超速离心机转速：2.5×104－12×104r/min相对离心力：5×105g主要用途：分离DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化。超速离心机的精密相当高。为了防止样品液溢出，一般附有离心帽；为了防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统；为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统。此外还有一系列安全保护系统、制动系统及指示仪表等。原理：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在大离心力的条件下进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”，如此，多次离心处理，即能把液体中的不同沉降速度的颗粒分批分离出来。常用于分离大小和密度相差较大的颗粒。1）差速离心法（2）离心方法的选用2）密度梯度离心

（densitygradientcentrifugal）原理：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。

每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。梯度介质选择标准：应具有足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围；不与样品中的组分发生反应；不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。常用介质：蔗糖、甘油蔗糖：浓度5%~60%，密度1.02~1.30g/cm24、凝胶过滤法原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。层析(色谱）分子筛—

凝胶过滤法葡聚糖凝胶

SephadexG:

有SephadexG-10~G-200共8种型号；G后面的数字是表示不同的交联度，数字越大，交联度越小，吸水量越大，其数值越为吸水量的10倍；pH稳定范围为2-11；分子量分级范围为~8105；亲水性强。凝胶的类型与选择：Sephadex

葡聚糖凝胶Sephacryl凝胶葡聚糖凝胶：

商品名Sephadex或Bio-gelA，它是由链状葡聚糖通过交联剂聚合而成；聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP：有Bio-GelP2~Bio-GelP300共10个型号；P后面的数字乘以1000表示其分离的最大分子量（排阻分子量）；过酸或过碱时不稳定；在pH5.5-6.5时可以高压灭菌；在大多数缓冲液中都可使用；pH稳定范围为2-10；分级范围为1102~6104。

琼脂糖凝胶:

有Sepharose；是从海藻中提取出来的多糖混和物;凝胶的孔径大小是通过琼脂糖浓度来控制的；分级范围很宽；但对温度要求严格（2-30℃），40℃以上时易融化，低于0℃时易堵塞。凝胶过滤法Flash(一)沉淀分离

沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。二、根据溶解度建立的分离方法1、盐析(SaltingOut)法

最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。加入饱和硫酸铵：100ml溶液中，由饱和度S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数V=V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”。⑴基本原理

有机溶剂对于许多蛋白质(酶),核酸,多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用,是较早使用的沉淀方法之一.

其原理主要是:

①降低水溶液的介电常数,导致蛋白质溶解度降低而沉淀.（F=Q1Q2/εr2

）

②由于使用的有机溶剂与水互溶,它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子,破坏了蛋白质分子的水膜,因而发生沉淀作用.2、有机溶剂沉淀法常用：乙醇,甲醇和丙酮.①分辨能力比盐析法高,即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀.

②沉淀不用脱盐,过滤比较容易(如有必要,可用透析袋脱有机溶剂).因而在生化制备中有广泛的应用.有机溶剂沉淀法的优点是:有机溶剂沉淀法的缺点：

对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作需在低温下进行.1)温度:

酶在有机溶剂中对温度特别敏感,温度稍高就会引起变性,且有机溶剂与水混合时产生放热反应,因此有机溶剂必须预冷,操作要在冰盐浴中进行.一般都要在低温下进行（0℃±1℃）2)样品浓度:

低浓度样品回收率低,要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀.高浓度样品,可以节省有机溶剂,减少变性的危险,但杂蛋白的共沉淀作用大.

选择适当的蛋白质浓度才能达到较好的分离效果。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜.有机溶剂沉淀的影响因素3)pH值:

选择在样品稳定的pH值范围内,通常是选在等电点附近,从而提高此沉淀法的分辨能力.

4)离子强度:

通常盐浓度以不超过5%为宜,使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜,

中性盐的加入能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，并能防止蛋白质变性，一般采用0.05mol/L以下的稀盐溶液。沉淀所得的固体样品,如果不是立即溶解进行下一步的分离,则应尽可能抽干沉淀,减少其中有机溶剂的含量,如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂,以免影响样品的生物活性.3、等电点沉淀法

利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性,通过调节溶液的值，使酶或杂质沉淀析出，从而实现酶与杂质分离的方法.

可以利用此法进行初步的沉淀分离.

由于许多蛋白质的等电点十分接近,而且带有水膜的酶等生物大分子仍有一定的溶解度,不能完全沉淀析出,因此,单独使用此法分辨率较低,因而此法常与盐析法,有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用,以提高沉淀能力和分离效果.

此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白,而不用于沉淀目的物.

4、复合沉淀法

在酶液中加入某些物质，使其与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法.

常用的复合沉淀剂有：聚乙二醇、聚丙烯酸、单宁.

如聚丙烯酸（PAA）可以与某些碱性酶蛋白，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：

PAA+酶PAA-酶

PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO42-CaSO4+PAA5、选择性变性沉淀法选择一定的条件使爵液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的畸，从而使酶与杂质分离

热变性、有机溶剂变性和pH变性

α-淀粉酶——热变性红细胞酶——乙醇-氯仿(二)萃取分离

萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其他流体。有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取

有机溶剂萃取的两相分别为水相和有机溶剂相，利用溶质在水和有机溶剂中的溶解度不同而达到分离。乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如:用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶；用苯酚萃取RNA等。

注意事项:(1)低温操作;(2)尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间.1.有机溶剂萃取2.双水相萃取适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯化目的酶。原理：利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。开始于20世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激素、病毒等分离提纯。技术诞生

1896年Beijerinck观察到明胶-琼脂水溶液混合、明胶-淀粉水溶液混合先得到一浑浊不透明溶液，随后分为两相。1）两相的组成

2）高分子聚合物的分子量、浓度、极性等

3）两相溶液的比例

4）酶的分子量、电荷、极性等

5）温度、pH值等影响酶在两相中分配系数的因素双水相萃取技术的优点双水相体系为酶的溶解和抽提提供了适宜环境，而且处理容量大。设备简单。操作方便、快速、条件温和。不需处理就可与后续提纯步骤相衔接。几种典型的双水相萃取酶蛋白实例

酶菌种相系统延胡索酸酶BrevibacteriumspPEG/盐天冬氨酸酶E.coliPEG/盐-半乳糖苷酶E.coliPEG/盐亮氨酸脱氢酶BacillussphaericusPEG/Dex乙醇脱氢酶Baker’syeastPEG/盐青霉素酰化酶E.coliPEG/盐3.超临界萃取

超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。

超临界流体4.反胶束萃取

反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。反胶束，又称为反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。三、按蛋白质电荷性质设计的分离方法吸附法（吸附交换分离法）电泳法离子交换色谱

根据吸附机制的不同可分为3种：物理吸附法，羟基磷灰石法和离子交换吸附法。是利用样品中不同分子与吸附剂之间的吸附和解吸性质不同而达到分离的目的；操作方式有静态吸附和柱层析两种方式。操作过程包括：吸附剂的平衡与活化，加样吸附，洗涤和洗脱。（一）吸附法（吸附交换分离法）

常用的吸附剂有硅藻土，活性氧化铝，淀粉和活性炭等。预先洗涤和活化后，在低盐，弱酸或近中性条件下加样吸附，再在弱碱条件下进行洗脱。常采用静态方式进行。1、物理吸附法：

羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；也是在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；多采用柱层析方式进行。2、羟基磷灰石法

利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。离子交换剂：一般由高分子支持介质（母体）和功能基团（离子交换基）两部分组成。根据高分子支持介质的性质可以将离子交换剂分为3种类型：离子交换树脂，离子交换纤维素和离子交换球型多糖(如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等)。3、离子交换吸附法（离子交换色谱法）离子交换树脂

是一种特殊网状结构的高分子化合物，其母体原料是一些不溶性的交联聚苯乙烯等，活性基团通过化学反应连在母体上。离子交换纤维素

是目前酶分离纯化中应用最广泛的一种离子交换剂；是在纤维素母体上引入功能基团组成的。离子交换球型多糖

以交联葡聚糖或交联琼脂糖为母体，引入功能基团而成的。强酸型(硝酸基)阳离子交换剂弱酸型(羧基)阳离子交换剂强碱型(季胺盐)阴离子交换剂弱碱型(伯胺基)阴离子交换剂等。

根据离子交换基所带电荷性质和解离状况可以分为：离子交换剂类型的选择,应考虑以下几个因素：参考电泳结果：在中性或偏碱性条件下进行电泳，向阳极移动较快的酶，可选用阴离子交换剂；向阴极移动较快的酶可被阳离子交换剂吸附。待分离酶的稳定性：待分离酶如果在低于pI的条件下稳定，则选用阳离子交换剂；待分离酶如果在高于pI的条件下稳定，则选用阴离子交换剂。待分离酶的pI：pI<6时选用强碱型阴离子交换剂；pI>9时选用强酸型阳离子交换剂；pI在6-9之间选用强型弱型均可。

离子交换层析的操作过程：包括离子交换剂的预处理及平衡，装柱，加样吸附，洗脱，洗脱液收集及检测，离子交换剂的再生。（二）电泳法

在直流电场中，由于各种蛋白质分子所带电荷不同，移动速度不同，形成各自的区带，用显色剂如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白质的颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。

带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。膜电泳：以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。粉末电泳：以淀粉、纤维素粉或硅胶粉等为支持物的分离方法。凝胶电泳：以聚丙烯酰胺为支持物，兼有分子筛效应。1、区带电泳：是在惰性支持物上进行电泳时样品中各组分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳分离方法。按支持物的物理性状可分为3种类型：上：凝胶电泳左：纸电泳凝胶电泳测分子量2、等点聚焦电泳

当等电点不同的蛋白质分子处于一个由阳极到阴极pH值梯度逐渐增加的介质中,并通以直流电,“聚焦”在与其等电点相同的pH值位置上，形成位置各异的不同区带，这种电泳方法称为等点聚焦电泳。这种方法可以区分等电点只有0.01pH值单位差异的蛋白质。

电泳中pH值梯度的形成取决于两性蛋白质载体。在电泳系统中加入不同等电点的两性电解质载体，通入直流电后，即在电场作用下形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。目前主要采用的商品载体两性电解质是Ampholine,它是一系列不同等电点的脂肪族多氨基多羧基同系物及异构物的混合物3、高效毛细管电泳4、聚焦层析垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳圆盘电泳

(三)离子交换色谱

离子交换层析是利用在离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种物质的吸附力不同而使不同物质分离的方法。离子交换剂分为两部分：一部分是不能移动的多价的高分子基团，构成骨架；另一部分是活性离子，它在树脂中进出发生离子交换。活性离子是阳离子，能吸附阴离子的称为阳离子交换树脂；相反则称为阴离子交换树脂。离子交换法离子交换Flash四、根据亲和作用建立的纯化方法

由于酶对底物，竞争性抑制剂,辅酶等配体具有较高的亲和力，而其它杂蛋白对这些配体则没有或有很弱的亲和作用，因此，可以根据酶与杂蛋白对配体亲和力的差异，很容易地将酶分离出来。目前已经建立的方法有亲和层析法和亲和电泳法等。1、亲和层析法：

亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.亲和层析的四个要素载体配体臂待分离组分亲和吸附洗涤洗脱再生杂蛋白目的酶图.