杜仲成分的提取与分离

一杜仲是我国特有的一种传统的名贵中药材，具有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增强机体免疫力、治疗心血管疾病等生物活性，其药用价值历来受到人们的关注［1］。在早期的报道中主要是针对杜仲皮的研究，但是杜仲皮取材困难、成本高。大量现代医学研究证实了杜仲叶与皮的化学成分基本一致，具有同等功效，特别是绿原酸和黄酮的含量远高于皮中的含量，因此，对产量高、价格便宜的杜仲叶中有效成分进行研究具有一定的实用价值。笔者研究NKA-II树脂对杜仲叶中绿原酸和黄酮类化合物吸附和分离的效果，并对其分离工艺进行优化，以期为杜仲叶相关产品的深开发与生产提供参考。4二，Heidolph旋转蒸发仪，UNICOUV-2102PC型分光光度计；芦丁标准品、绿原酸标准品（中国药品生物制品检定所），其它试剂均为分析纯。1.2样品预处理及测定方法1.2.1样品预处理用70%乙醇水溶液作为提取剂，按照料液比1:12,pH值为4,每次提取25min,提取3次，合并滤液并浓缩至无醇味后，冷冻干燥，得到杜仲叶粗提物，在干燥避光条件下保存。1.2.2绿原酸及总黄酮的测定紫外可见分光光度法测定绿原酸的含量［3］和总黄酮的含量［2］。1.2.3高效液相色谱法（HPLC）检测杜仲叶分离产物色谱条件色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18（100mmX2.1mm,1.7|im）（美国WATERS公司）；柱温25°C;流速0.35mL/min；检测波长365nm；进样量5UL；流动相采用梯度洗脱。1.3树脂的选择采用9种大孔吸附树脂对杜仲叶中绿原酸、总黄酮的吸附-解吸分离性能进行研究，可为规模化分离绿原酸、总黄酮提供理论依据。1.4大孔树脂预处理先将各种树脂分别用蒸馏水溶胀12h后浮选，然后用95%乙醇浸泡24h后，用蒸馏水洗至无浑浊现象，无醇味为止。再用1mol/LNaOH溶液浸泡24h,用蒸馏水洗至中性。然后用1mol/LHCl浸泡24h,用蒸馏水洗至中性。最后用20%乙醇浸泡储备。1.5静态吸附-解吸试验首先对9种大孔树脂的吸附量、吸附率和解吸率进行测定［5］,其次分别考察吸附液pH值和不同乙醇浓度对NKA-11树脂静态吸附的影响［6］。1.6动态吸附-洗脱试验在室温下，根据静态吸附-解吸试验的条件,考察上柱液流速、上柱液浓度、洗脱剂流速对NKA-II树脂动态吸附-洗脱性能的影响，作动态吸附曲线和洗脱曲线，确定最佳动态吸附-洗脱工艺条件。1.7扩大试验及高效液相色谱检测称取5kg杜仲叶，先用NKA-II大孔树脂进行分离，将30%、50%、70%的乙醇洗脱液分别浓缩，再用聚酰胺树脂和SephadexLH-20树脂进行纯化，最后将分离纯化的产物进行高效液相色谱检测，操作条件见1.2.3。2结果与分析2.1大孔树脂的静态吸附-解吸试验2.1.1大孔吸附树脂对绿原酸、总黄酮的静态吸附效果比较试验所用树脂有极性、弱极性、非极性三种类型，这9种大孔吸附树脂对绿原酸、总黄酮的静态吸附-解吸情况见表2。从表2可以看出，NKA-II在静态饱和吸附时对绿原酸、总黄酮不仅具有较高的吸附量，而且解吸率也较高，所以确定NKA-II为最佳树脂，并进行动态吸附-洗脱试验。NKA-II树脂对绿原酸、总黄酮的静态吸附动力学曲线在给予充分时间吸附的情况下，由图1可见，绿原酸和总黄酮在NKA-II树脂上的动力第12期张玲等：杜仲叶绿原酸总黄酮的分离纯化及检测123表3上柱液浓度对NKA-II树脂动态吸附性能的影响上样液浓度1/20C0图4不同乙醇浓度对NKA-II树脂静态解吸的影响学过程如下：在起始阶段吸附速率较大；但4h之后，树脂基本达到吸附平衡；随着吸附时间的继续延长，吸附量的增加速率减小。根据吸附动力学曲线，NKA-II树脂对杜仲叶粗提物中绿原酸和总黄酮的吸附属于快速平衡型树脂。2.1.3吸附等温线将浓度为CO的杜仲叶粗提物溶液（含绿原酸3.734mg/mL和总黄酮14.018mg/mL）分别稀释成不同浓度的静态吸附液，称取5.000g（干基）的NKA-II树脂，振荡条件同文献[4],计算吸附率，作吸附等温线，结果见图2。吸附等温线的初始阶段几乎呈线性的，表明低浓度上样液中的活性成分可以在树脂中高度扩散。当树脂表面形成分子层吸附饱和后，溶液中的黄酮化合物在外层再以氢键的方式与表面吸附的黄酮吸附，但由于孔容的限制，所以存在一个极限，这与李云志等［7］和李莹等［8］研究显示的现象一致。由图可知，当总黄酮的平衡浓度为5.93mg/mL时达饱和吸附，总黄酮的饱和吸附量为91.75mg/g树脂。2.1.4吸附液的pH值对NKA-II树脂吸附的影响由图3看出，在pH值为4时，NKA-II树脂对绿原酸和黄酮类化合物的吸附率均达到最大，说明在此条件下，绿原酸和黄酮类化合物均以分子形式存在，较稳定，故吸附效果最好。当酸性较强时，易形成“佯盐”；在偏碱性时，分子中酚羟基H+易失去，形成离子结构，不易被吸附。2.1.5不同乙醇浓度对NKA-II树脂静态解吸的影响图4表明，静态解吸效果随着乙醇水溶液体积分数的提高而增强，当浓度达到70%时，解吸平衡。同时检测发现，低浓度乙醇溶液有利于绿原酸类化合物的解吸，而高浓度乙醇溶液则有利于黄酮类化合物的解吸，说明采用梯度洗脱有利于绿原酸与黄酮类化合物的分离。NKA-II树脂对绿原酸、总黄酮的动态吸附性能2.2.1NKA-II树脂的动态吸附渗透曲线将含绿原酸和总黄酮浓度分别为0.901mg/mL和3.441mg/mL的上样液以1.0mL/min流速上柱，直至树脂吸附饱和为止。以一个柱体积为单位收集流出液，测定流出液中绿原酸、总黄酮的浓度C'，C为上样液浓度，用C'/C表示渗透系数，绘制吸附渗透曲线，结果见图5。流出液的浓度达到进样液浓度的1/10时（即C'/C=0.1）时，认为已达到吸附的穿透点，停止进样，表明此条件下，上样量不应超过10倍的柱体积。2.2.2上柱液浓度对NKA-II树脂动态吸附性能的影响将浓度为C0（含绿原酸9.012mg/mL,含总黄酮34.406mg/mL）的上样液用水稀释成不同浓度，分别取等体积的不同浓度的上柱液，在相同的流速下，进行动态吸附试验，检测上柱液浓度对大孔树脂动态吸附性能的影响，结果见表3。大孔吸附树脂的吸附量通常与上样液浓度成反比，在相同流速和相同吸附时间下，若上柱液浓度过大，由于孔容的限制，存在一个吸附极限，所以会有更多的有效物质未被充分吸附而流出。考虑到124湖南农业科学第12期张玲等：杜仲叶绿原酸总黄酮的分离纯化及检测表4吸附流速对NKA-II树脂动态吸附性能的影响（％）流速图6NKA-II树脂对绿原酸、总黄酮的动态洗脱曲线一般泄漏率不应大于10%，因此上柱液浓度应小于2/10C0。2.2.3吸附流速对NKA-II树脂动态吸附性能的影响吸附流速主要影响溶质向树脂表面扩散，从而决定了吸附效果。如果吸附流速过大，就会使树脂的吸附量下降；如果流速过小，则生产周期延长，效率降低。由于泄漏点不应大于0.1，根据表4数据显示，流速选择0.8〜1.5mL/min较好，故试验选择1.0mL/min,此时绿原酸的吸附量是13.18mg/g,总黄酮的吸附量是47.66mg/g。NKA-II树脂对杜仲叶粗提物实际的动态吸附-洗脱试验NKA-II树脂的动态吸附渗透曲线见图5。根据已确定的最佳吸附-洗脱条件,采用乙醇-水为洗脱体系,进行梯度洗脱,部分收集各段馏分,洗脱曲线见图6。结果显示：1〜6管为水洗洗脱液,其中主要含有多糖、蛋白质、鞣质等大分子物质；7〜14管为30%乙醇洗脱液,主要含绿原酸类等强极性物质；15〜32管为50%乙醇洗脱液,主要含与芦丁极性相似的黄酮类化合物；33〜53管为70%乙醇洗脱液，含有大量极性较弱的黄酮类化合物，如槲皮素、槲皮苷等；54〜70管为95%的高浓度乙醇洗脱液，将大孔树脂中残留的弱极性脂溶性物质去除。2.4杜仲叶有效成分的纯化根据最佳吸附-解吸条件，进行扩大试验，分别将30%、50%、70%的乙醇洗脱液浓缩，冷冻干燥后，采用聚酰胺树脂和SaphadexLH-20树脂纯化得到4种组分，经过高效液相色谱检测，各组分的峰面积比均超过95%。将杜仲叶分离产物的出峰时间与标准品出峰时间对照，经薄层层析结果分析、紫外光谱检测，参考张培成，田燕［7-8］的报道，可以判断笔者研究所分离的4种组分可能为：绿原酸、金丝桃苷或陆地锦苷、槲