紫外可见分光光度法-2015

紫外可见分光光度法

与荧光分光光度法药物研究所分析室马辰2015.3.27紫外可见分光光度法

1、紫外光谱与分子结构的关系2、紫外可见分光光度计3、定量测定基本原理

4、定性与定量方法5、光电比色法吸收光谱的来源

所有原子和分子均能吸收电磁波，其对吸收的波长有选择性。这种现象的产生主要是因为原子和分子的能量具有量子化特征在正常状态下的原子或分子处于一定能级即基态，经光激发后，随激发光子能量的大小，其能级提高一级或数级，即分子由基态跃迁到激发态。当以某一范围的光波连续照射分子或原子时，有些波长的光被吸收，产生被吸收谱线所组成的吸收光谱分子的吸收光谱分为三类转动：只涉及分子转动能级的改变，能级间距离很小，吸收光子的波长长，频率低。能级相差10-3~10-2kcal/mol，单纯的转动光谱发生在远红外区和微波区振动：振动光谱反映分子转动和振动能级改变，引起这种改变的光子能量比第一种高，两个振动能级相距0.1~10kcal/mol，产生于波长较短，频率较高的近红外区，主要在1~30µ的波长区。电子光谱：吸收光子后使电子跃迁，产生电子能级的改变，即为电子光谱。能量为20~300kcal/mol。电子光谱位于紫外区和可见区，其波长和能量的关系波长(nm)180200300400波数(cm-1)55555500003000025000能量1591439572(kcal/mol)紫外区与可见区波长(nm)真空紫外区10~185远紫外区185~200短紫外区200~300近紫外区300~380紫色380~400蓝色400~500绿色500~580黄色580~600橙色600~620红色620~780紫外吸收光谱反映分子吸收能量后所产生的电子跃迁，反映分子的电子结构特征，为物质结构的研究提供重要信息，分子的紫外光谱吸收带的波长和强度是化合物的常数之一。由于仪器和操作方法的限制，紫外光谱只适合于具有不饱和双键系统的分子。电子跃迁受分子结构的影响，所以紫外光谱能部分反映分子中电子间的相互作用。紫外光谱与红外光谱的区别紫外光谱图形简单，吸收峰宽且成带状，红外光谱吸收峰较尖且数目多。紫外光谱主要反映分子中不饱和基团的性质，而不反映整个分子的结构；红外光谱则不仅能反映分子中功能基团的存在，而且与整个分子的结构有关。特点紫外光谱不仅能识别分子中的不饱和系统，而且可以测定不饱和化合物的含量同一物质相同浓度的吸收曲线，应能相互重合，这是定性鉴定的依据之一。在定量分析中，可提供选择测定的适宜波长。因所需样品量少，通常为微克级或毫克级，所以对测定微量成分，尤其是生物体内的有机化合物更为有利。紫外光谱与分子结构的关系1.电子跃迁类型2.常用术语3.吸收带4.溶剂效应电子跃迁类型电子围绕分子或原子运动的几率分布叫轨道。轨道不同电子所具有的能量不同。紫外可见吸收光谱是讨论分子中的价电子有处于σ轨道上的σ电子，π轨道上的π电子和未参与成键而仍处于原子轨道中的n电子（亦称p电子）。

分子轨道可以认为是当两个原子靠近而结合成分子时，两个原子的原子轨道的s电子就可以线性组合生成两个分子轨道。其中一个分子轨道具有低能量称为成键轨道σ。另一个分子轨道具有高能量称为反键轨道σ*。

同样两个原子的π轨道平行地重叠起来，组成两个分子轨道时，该分子轨道称π轨道和π*反键轨道。

π键的电子重叠比σ键的电子重叠少，键能弱，跃迁所需的能量低。分子中n电子的能级，基本上保持原来原子状态的能级，称非键轨道。比成键轨道所处能级高，比反键轨道能级低。分子中不同轨道的价电子具有不同能量，处于低能级的价电子吸收一定能量后，会跃迁到较高能级。分子中电子跃迁有以下几种类型σ→σ*跃迁σ成键轨道上的电子吸收光能后跃迁到σ*反键轨道。需较大能量，吸收峰在远紫外区，一般都小于150nm,在200nm―400nm范围内没有吸收。π→π*跃迁π成键轨道上的电子吸收光能后跃迁到π*反键轨道，所需的能量小于σ→σ*跃迁的能量。孤立的π→π*跃迁一般在200nm左右，特征是吸收系数值很大，一般ε>104,为强吸收。若具有共轭双键化合物，相间的π键与π键相互作用形成离域键跃迁，电子容易激发，使π→π*跃迁所需能量减少，共轭键越长跃迁所需能量越小。n→π*跃迁

含有杂原子不饱和基团，如C=O,C=S,-N=N-等化合物，其非键轨道中孤对电子吸收能量后，向π*反键轨道跃迁，这种跃迁一般在近紫外区（200400nm）,吸收强度弱，ε小，约在10100之间。n→σ*跃迁如含有-OH，-NH2，-X，-S等基团化合物，其杂原子中孤对电子吸收能量后向σ*反键轨道跃迁，这种跃迁所吸收的波长在200nm左右。

上述4种类型的电子跃迁，按照所需能量大小其顺序为：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*常用术语生色团（chromophore）有机化合物分子结构中含有π→π*或n→π*跃迁的基团，如C=C，C=O，-N=N-，-NO2，-C=S等，能在紫外可见光范围内产生吸收的原子团。助色团（auxochrome）是指含有非键电子的杂原子饱和基团，如-OH，-NH2，-OR，-SH，-SR，-Cl，-Br,-I等当它们与生色团或饱和烃相连时，能使该生色团的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加的基团。3．红移(redshift)也称长移，由于化合物结构改变，如发生共轭作用，引入助色团以及溶剂改变等，使吸收峰向长波方向移动。4．蓝（紫）移(blueshift)也称短移。当化合物的结构改变时或受溶剂影响使吸收峰向短波方向移动。增色效应(hyperchromiceffect)由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加。减色效应(hypochromiceffect)使吸收强度减弱。强带和弱带(strongbandandweakband)化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸收系数εmax值大于104的吸收峰称为强带；凡εmax值小于103的吸收峰称为弱带。吸收带（absorption）

R带由n→π*跃迁引起的吸收带。是杂原子的不饱和基团，如C=O，-NO，-NO2，-N=N-等这一类发色团的特征。特点：1处于较长波长范围（300nm）弱吸收，一般小于1002溶剂极性增加，R带发生短移。3当有强吸收峰在其附近时，R带有时出现长移，有时被掩盖。因此，若测定n→π*跃迁要用较浓溶液；在非极性溶剂中吸收峰在较长波长处，若改用极性溶剂时，吸收峰短移，说明R带存在。K带相当于共轭双键π→π*跃迁所产生的吸收峰。特点：值一般大于104，为强吸收带。B带芳香族（包括杂芳香族）化合物的特征吸收带。E带也是芳香族化合物特征吸收，认为是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭体系的π→π*跃迁所产生，分为E1和E2。E1带的吸收峰约在180nm，为4.7104;E2带的吸收峰约在200nm,为7000。溶剂效应化合物在溶剂中的紫外吸收光谱受溶剂影响较大，所以一般应注明所用溶剂。溶剂的极性不同，对n→π*跃迁和π→π*跃迁所产生的吸收峰位置向不同方向移动改用极性较大的溶剂，使π→π*跃迁吸收峰向长波方向移动而n→π*跃迁吸收峰蓝移后者的移动一般比前者移动大溶剂要求不能与样品反应样品溶液中能达到一定浓度在所测定的波长范围内，溶剂没有吸收常用溶剂的极限吸收波长溶剂波长（nm）乙腈190环己烷198水200甲醇202乙醇205异丙醇203三氯甲烷245乙酸乙酯254DMSO265吡啶305吸收强度当光经过均匀的透明介质时，一部分在介质的表面分散或反射，一部分为介质所吸收，只有一部分可透过介质，故透过光的强度减弱。反射光在测定中可用空白校正而忽略不计。一个透明介质所吸收的能量和照射光的强度无关，与吸收光子的物质的浓度和介质的厚度有关。分子的紫外光谱有两个特征：吸收带的波长决定于分子激发态和基态的能级。若两个能级相距小，则跃迁所需的能量低，吸收带的波长长。但能级相差大时，跃迁能高，吸收带波长短。吸收强度，一般认为吸收强度决定于从基态跃迁到某一能级的几率或吸光分子的多少。分子吸光系数可以表示为ε=kpαk为一常数，其级数为1020，p为几率α为分子横切面积。分子中吸收光子的有关电子跃迁部分的面积。面积大，容易被击中，强度大。紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计是在紫外可见光可任意选择不同波长的光测定吸光度的仪器。示意图光源→单色器→吸收池→检测器→讯号处理及显示器光源

要求足够发射强度且稳定的具有连续光谱且发光面积小的光源。对分子吸收测定来说，通常希望能连续改变测量波长进行扫描的测定，故分光光度计要求具有连续光谱的光源。钨灯或卤钨灯固体炽热发光，用于可见区光源。要求供电电压稳定。氢灯或氘灯气体放电发光，发射自150nm至约400nm的连续光谱，用于紫外区光源。单色器

单色器的作用是将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带。单色器由进口狭缝、准直镜、色散元件、聚焦透镜、出口狭缝组成。1.色散元件

使各种不同波长的平行光有互不相同的投射方向（或偏转角），是单色器中最重要的。棱镜光栅

棱镜

棱镜的色散作用由于棱镜材料对不同波长的光有不同的折光率，因此可从混合光中所包含的各个波长从长波长到短波长依次分散成为一个连续光谱。棱镜分光得到的光谱按波长排列是疏密不均的长波长密，短波长疏，即光距与各条波长是非线形的棱镜材料有玻璃和石英两种，玻璃对可见区的色散率比石英大，石英对紫外光有很好的色散作用，但在可见区不如玻璃。

光栅是一高度抛光的表面上刻出大量平行等距离的槽。

射到每一条槽上的光被衍射或散开成一定的角度，在其中的某些方向产生干涉作用，使不同波长的光有不同方向，出现各级明暗条纹形成光栅的各级衍射光谱。光栅色散后的光谱与棱镜不同，光栅的光谱是由紫到红，各谱线间距离相等，是均匀分布的连续光谱。光栅光谱是多级光谱，各级重叠，相互干扰，需用滤光片滤去高级序光谱。2.准直镜

以狭缝为焦点的聚光镜。将进入单色器的发散光变成平行光，又用作聚光镜，将色散后的平行单色光聚集于出口狭缝。一般用镀铝的抛物柱面反射镜作为准直镜。3.狭缝狭缝宽度直接影响分光质量，狭缝过宽，单色光不纯，可使吸光度变值;狭缝过窄，光通量小，降低灵敏度，若增大放大器放大倍数而使噪音增大，影响准确度。吸收池用光学玻璃制成的吸收池，只能用于可见光区。用熔融石英（氧化硅）制的吸收池，适用于紫外光区，也可用于可见光区。空白溶液的吸收池与样品溶液的吸收池应相互匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。检测器

一般常用光电效应检测器（光电池和光电管），将接收到的辐射功率变成电流的转换器。光电池光电管光电倍增管光二极管阵列检测器

光电池

是一种光敏半导体，当光照时就产生电流，在一定范围内光电流大小与照射光强成正比，可直接用微电流计测量。光电池有硒光电池和硅光电池。硒光电池只能用于可见光区，硅光电池同时适用于紫外区和可见区。

光电管

光电管是由一个阳极和一个光敏阴极组成的真空（或充少量惰性气体）二极管，阴极表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏材料，当它被有足够能量的光照射时，能够发射出电子。当两极间有电位差时，发射出的电子向阳极移动而产生电流，电流大小决定于照射光强度。

光电倍增管

原理与光电管相似，结构的差别是在涂有光敏金属的阴极和阳极之间还有几个倍增级（一般是9个）。

仪器灵敏度大大提高。

光二极管阵列检测器

在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管检测管，每一个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝。讯号处理及显示器

光电管输出的电讯号很弱，须经放大才能以某种方式将测量结果显示出来。显示器的显示方式一般都有透光率与吸收度，有的还可以转换成浓度，吸光系数等显示定量测定基本原理

Beer-Lambert定律

A=lgT=ElC说明物质对单色光吸收强弱与吸光的浓度和厚度间关系的定律.T=I/I0I:透过光强度I0：入射光强度

吸光系数:单位浓度及单位厚度时的吸光度称为吸光系数(absorptivity)。吸光度与浓度或厚度之间是简单的正比关系,其中E是比例常数。吸光系数有两种常见的表示方式

摩尔吸光系数是指在一定波长时,溶液浓度为1mol/L,厚度为1cm的吸光度,用或EM标记.

百分吸光系数，或称为比吸光系数，是指在一定波长时,溶液浓度为1%(W/V),厚度为1cm的吸光度,用E1%

1cm表示。吸光系数两种表示方式之间的关系是：

=M/10E1%

1cm

2．影响测定的因素A=lgT=ElCT=I/I0化学因素：光学因素

化学因素：溶液中溶质可因浓度改变，有离解，缔合与溶剂间作用等因素。2）光学因素：

非单色光：Beer定律的前提是单色光，主要原因是由于物质对不同波长的光有不同的吸收系数。事实上真正的单色光难以得到。

杂散光：从分光器得到的单色光中，有一些不在谱带宽范围内的与所需波长相隔较远的光。一般来源于仪器制造过程中的瑕疵，仪器保养不善，光学元件受到尘染或霉蚀是杂散光增多的常见原因。散射光和反射光：吸光质点对入射光有散射作用，入射光在吸收池内外界面之间通过时又有反射作用。散射光和反射光都是入射光谱带宽度内的光，对透射光强度有直接影响。非平行光：斜光通过吸收池的光程比平行光的光程长。定性与定量方法1、定性鉴别2、纯度检验3、定量测定一．定性鉴别主要依据多数有机化合物具有吸收光谱特征，如形状，吸收峰数目，吸收峰波长位置，强度和吸收系数值等。利用紫外可见分光光度法进行化合物的定性鉴别，一般采用将样品化合物的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征对照比较，两者完全相同，则可能是同一化合物，两者有明显差别，则肯定不是同一种化合物。1、对比吸收光谱特征数据最常用于鉴别的吸收光谱特征数据是吸收峰所在的波长。若一个化合物有几个吸收峰，并存在谷及肩峰，应同时作为鉴定依据。具有相同或不同的吸收基团的不同化合物，可有相同的吸收峰值，但它们的分子量一般不同，因此其E值有明显不同，所以，吸光系数常用于化合物定性鉴别。2、对比吸光度（或吸收系数）的比值

吸收峰多于一个的化合物，可用在不同吸收峰处（或峰与谷）测得吸光度的比值作为鉴别的依据。A1E1ClE1——=———=——A2E2ClE23、对比吸收光谱的一致性将试样与已知标准品配制成相同浓度的溶液，在同一条件下分别描绘吸收光谱，核对其一致性。用紫外吸收光谱数据或曲线进行定性鉴别，有一定的局限性。因为紫外吸收光谱一般只有1个或几个宽吸收带，曲线的形状变化不多；在众多化合物中，不相同的化合物可以有很类似甚至雷同的吸收光谱。所以在得到相同的吸收光谱时，应考虑到有并非同一物质的可能性。而两种纯化合物的吸收光谱有明显差别时，却可以肯定不是同一化合物。二．纯度检验1、杂质检查如果化合物在紫外可见区无明显吸收，杂质有较强吸收，那么杂质可用光谱检查出来。如果化合物有较强的吸收峰，而杂质在此波长处无吸收，或吸收很弱，杂质的存在使化合物的吸光系数值降低；若杂质在此波长处有比化合物更强的吸收，将使化合物的吸光系数值增大；有吸收的杂质也将使化合物的吸收光谱变形；这些都可作为检查杂质是否存在的方法。2、杂质的限量检查药物中的杂质，须制定一个容许其存在的限量。利用杂质和化合物吸收峰的不同，测定杂质量。利用峰谷吸收度比值控制杂质限量。三．单组分的定量方法根据Beer定律，物质在一定波长处的吸收度与浓度之间有线形关系。选择一定的波长测定溶液的吸光度，即可求出浓度。

波长选择：1）光谱的最大吸收峰处；2）被测物如有几个吸收峰，选不易有其它物质干扰的较高的吸收峰；3）一般不选末端的吸收峰。

溶剂选择：不干扰被测组分的测定。1吸光系数法吸光系数法根据Beer定律，A=ElC，若l,E知，可根据测得的A求出被测物的浓度。

2标准曲线法先配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相同下，分别测定其吸收度然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸收度为纵坐标，绘制A―C关系图，如果符合Beer定律，可获得一条通过原点的直线。在相同条件下测定样品的吸光度，用回归方程计算样品溶液的浓度。3.对照法在同样条件下配制标准溶液，在选定波长处，分别测定吸光度，根据定律：A标=EC标lA样=EC样l因是同种物质，同台仪器及同一波长测定，故E，l相等，所以，A标C标=A样C样

A样·C标C样(%)=——————A标4．多组分的测定方法有两种或多种组分共存时，可根据各组分吸收光谱相互重叠的程度分别考虑测定方法。最简单的情况是各组分没有吸收峰重叠，则可按单组分的测定方法分别在各组分的最大波长处测定。1.解线性方程组法2.双波长分光光度法等吸收双波长消去法系数倍率法3三波长法4.导数光谱法五．光电比色法

可见分光光度法是对于能吸收可见光的有色溶液的测定方法，通常称为光电比色法。许多不吸收可见光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，用光电比色法测定，提高测定灵敏度和选择性。显色反应类型：络合反应，氧化还原反应，缩合反应等。应用最广的是络合反应。1.显色反应及其条件金属离子与配位体可形成稳定的有色络合物或络离子，吸收系数值可高达105，灵敏度高，有较好的选择性，适用于微量比色分析。1)显色反应需符合下述要求：被测物质与所生成的有色物质之间必须有确定的定量关系，才能使反应产物对光的吸收度准确地反映被测物的含量。反应产物必须有足够地稳定性，以保证测定的吸收度有一定的重现性。如试剂本身有色，则反应产物的颜色与试剂的颜色须有明显差别，即产物与试剂对光的最大吸收度应有较大的差别，才能分辨产物的吸收与试剂的吸收。反应产物的摩尔吸收系数足够大（103-105），才能有一定的灵敏度显色反应须有较好的选择性，才能减少干扰因素。2)反应条件的影响（1）试剂与溶剂选择试剂依据反应的灵敏度，显色的稳定性和反应的选择性，同时应考虑试剂的用量，为使产物组成一定，应控制试剂的用量。溶剂的性质可影响物质对光的吸收，使之显不同颜色。如：苦味酸在水溶液中呈黄色，而在氯仿中几乎无色。

（2）酸碱度

许多有色物质的颜色，随溶液中的氢离子浓度而改变，同时，显色反应的历程也多与溶液的酸碱度有关。络合反应中的络合剂多为弱酸，溶液的酸度大会阻碍络合剂离解，酸度过小又可使金属离子水解沉淀。氧化还原反应，缩合反应等，溶剂的酸碱性也是重要条件之一。有些反应对溶液的酸碱性敏感，须用缓冲溶液来保持溶液的pH值。

（3）时间由于反应速度不同，完成反应所需时间常有较大差异。有色产物也会在放置过程中发生变化，对一个显色反应中各个步骤所需时间和颜色所能稳定地保持多久，须经过实验确定。

（4）温度及其它

很多反应在室温下进行，室温的变动一般对结果影响不大。有些氧化还原或缩合反应，常须考虑温度，提高温度可促进反应，但也可产生副反应，须在适当温度下进行。有些反应与溶解度有关，也要考虑温度，提高温度促进溶解，有利于反应进行，或降低温度以避免沉淀溶解，都应根据具体的反应考虑适当的温度。见光易变质的产物，放置过程中应避光。3)反应条件的控制反应条件的控制确定显色反应的最适宜条件，须经过实验验证。2.测定方法有色溶液的测定可用前述紫外可见分光光度计和相应的各种方法。除此之外，可用初级的分光光度计以及以有色玻璃滤光片作为分光器的光电比色计。荧光分光光度法荧光的定义某些物质对特定波长的光有一定的吸收，从而产生吸收光谱有些物质受到光照射时，除吸收某些波长的光外，还会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停止照射后，这种光线也随之消失，这种光叫荧光。原子荧光：被测物质是原子分子荧光：被测物质是分子荧光分析一般分为三种1.X射线荧光分析（X射线）2.原子荧光分析（激光）3.分子荧光分析（汞弧灯）优势1）灵敏度高10-10~10-12g/ml，UV10-7g/ml2）信息多:激发分光光谱（信息同于UV）、发射光光谱的发光强度、发光寿命、量子效率、荧光偏振等多种信息,定性更好3）工作曲线的线性范围宽4）专一性强与UV异同点1)仪器构造与UV很相似.属于分光光度法,光源.单色器等2)组件的布置稍有不同荧光采用激发光和发射光成直角的直角光路3)原理不一样荧光的产生

分子能级和电子能级的多重性

单线态和三线态分子中的电子运动包括分子轨道运动和分子自旋运动，分子中的电子自旋状态，可以用多线态2S+1描述，S为总自旋量子数。若分子中没有未配对的电子，即S=0，则2S+1＝1，称为单线态；若分子中有两个自旋方向平行的未配对电子，即S=1，则2S+1＝3，称为三线态。荧光的产生荧光是电子由第一激发单线态最低振动能层至基态各振动能层之间的跃迁产生的磷光是电子由激发三线态最低振动能层至基态各振动能层之间的跃迁产生的振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞，将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。无辐射跃迁，发生弛豫的时间约为10-12秒内部能量转换（内转换）：两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。体系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。外部能量转换（外转换）：溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。荧光光谱荧光光谱包括激发光谱和发射光谱激发光谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率固定发射单色器，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度（F）对激发波长（λex）的关系曲线发射光谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是所发射的荧光中各种波长组成的相对强度使激发光波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相对的荧光强度，记录荧光强度（F）对发射波长（λem）的关系曲线荧光光谱将激发光谱与发射光谱进行比较，可以判断哪种吸收对发光有用。由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。

萘的激发光谱、荧光和磷光光谱芘的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫酸溶液的激发光谱、荧光光谱必要条件该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构分子必须有强的紫外-可见吸收，ππ*跃迁长共轭结构

该分子必须具有一定程度的荧光效率。所谓荧光效率是荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光